Après avoir cloné le gène d’intérêt dans le plasmide ITR adéno-associé, semez trois fois 10 jusqu’à la cinquième cellule dans une plaque à six puits en utilisant du DMEM préchauffé complété par 10% de FBS. Laissez les cellules se développer à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour atteindre 75 à 90% de confluence. Ensuite, dissolvez 100 milligrammes de chlorhydrate de polyéthylenimine ou PEI max dans 100 millilitres d’eau distillée pour obtenir un microgramme par microlitre de bouillon.
Ajustez le pH à 7,1 à l’aide d’hydroxyde de sodium. Stérilisez ensuite le mélange à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre et conservez le réactif pendant un mois à quatre degrés Celsius. Dans un tube de deux millilitres, ajoutez 1,3 microgramme de plasmide rep/capuchon, 1,3 microgramme d’ITR contenant un plasmide et 2,6 microgrammes de plasmide auxiliaire d’adénovirus au DMEM sans sérum.
Le volume total de ce mélange doit être de 100 microlitres. Préparez un témoin négatif dans un tube séparé, en remplaçant le plasmide rep/cap par un plasmide non apparenté. Ajoutez maintenant 5,2 microlitres de PEI max au mélange de plasmides.
Cela permet de maintenir un rapport plasmide/PEI égal. Tourbillonnez doucement 10 à 15 fois sur un mélangeur vortex réglé sur sept. Pour les vecteurs multiples, décalez l’ajout de PEI à des intervalles d’une minute pour un temps suffisant dans les étapes suivantes.
Incubez chaque tube pendant exactement 15 minutes à température ambiante. Diluez ensuite la réaction en ajoutant 1,9 millilitre de DMEM sans sérum pour obtenir un volume final de deux millilitres. Pipeter doucement deux fois pour mélanger le contenu.
Aspirer le milieu du puits. Ajouter soigneusement le mélange de plasmides PEI sur les côtés du puits pour éviter le détachement des cellules et incuber les cellules pendant 72 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, congelez la plaque de cellules transfectées pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius et décongelez-la pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Répétez le cycle trois fois au total. Dans une hotte à flux laminaire, mélangez chaque puits de manière aseptique par pipetage pour perturber efficacement les cellules. Transférez le lysat dans un tube de deux millilitres.
Centrifuger à 15 000 g pendant 15 minutes à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires et transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres et stocker le tube à quatre degrés Celsius. Ensuite, plaquez le type de cellule souhaité dans une plaque à 96 puits et incubez pour une confluence cible de 50 à 75 % selon la durée de transduction. Le lendemain, effectuer une série d’une à trois dilutions de la préparation brute dans un milieu sans sérum afin d’obtenir la quantité optimale de vecteur nécessaire à la transduction.
Ensuite, aspirez le média de la plaque à 96 puits et ajoutez 50 à 100 microlitres de préparation brute diluée dans les puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour déterminer l’efficacité de la transduction, observer l’expression du rapporteur fluorescent à l’aide d’un microscope fluorescent 48 heures après la transduction.
Pour une analyse plus approfondie, retirez le vecteur et lavez les cellules une fois avec du PBS préchauffé. Enfin, terminez la transduction en fixant les cellules dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes. Les données sur l’efficacité de la transduction ont suggéré que AAV2 et KP1 étaient les sérotypes les plus puissants dans toutes les lignées cellulaires testées.
HEPA1-6 a montré une diminution marquée de la transduction par rapport à Huh7. AAV2 a efficacement transduit les myoblastes HSKMC indifférenciés et les myotubes HSKMC différenciés. Différentes conditions de support jouent un rôle important lors de la transduction.
Les organoïdes de l’intestin grêle de souris cultivés dans des milieux de pré-transduction ont été moins efficacement transduits que ceux cultivés dans des milieux de croissance d’organoïdes.
