Pour commencer, prenez le mélange numérique gouttelettes décongelées ou ddPCR et ajoutez-y des sondes, une amorce directe et une amorce inverse à température ambiante. Préparer le mélange principal pour chaque cible d’amplification en suivant la composition suggérée affichée à l’écran et ajuster les concentrations des amorces et des sondes au besoin. Tourbillonner le mélange soigneusement et le centrifuger brièvement dans une mini-centrifugeuse.
Ajouter l’enzyme de restriction et retourner pour mélanger. Ensuite, ajoutez 16,5 microlitres du mélange principal préparé à chaque puits d’une plaque PCR et scellez la plaque avec un film adhésif transparent. En utilisant le tampon de dilution de l’échantillon comme diluant, préparer des dilutions de contrôle de la qualité ou de CQ comme indiqué dans ce tableau qui représente les concentrations recommandées pour une vérification de l’exactitude et de la précision.
Diluer les échantillons lacrymaux avec un tampon de dilution de l’échantillon dans un rapport de 1 à 10 dans des tubes PCR de 0,2 millilitre et sceller les tubes. Chauffer les échantillons dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis à 4 degrés Celsius pendant au moins 5 minutes. Retirer le film adhésif de la plaque de ddPCR contenant le mélange principal et ajouter 5,5 microlitres de dilution QC aux puits appropriés de la plaque de 96 puits, comme indiqué sur la carte des plaques.
Ajoutez ensuite 5,5 microlitres d’échantillon dans les puits. Ajouter 5,5 microlitres de tampon de dilution d’échantillon aux puits témoins sans gabarit ou NTC. Diluer 2x contrôle tampon ddPCR à un rapport de 1 à 2 en utilisant de l’eau sans nucléase et ajouter 22 microlitres du tampon à tous les puits vides d’une colonne.
Ajoutez un joint en aluminium perçable à la plaque et placez la plaque dans le scellant de plaque. Scellez la plaque pendant 5 secondes à 180 degrés Celsius. Tourbillonner la plaque à la vitesse maximale pendant au moins 30 secondes et centrifuger brièvement dans un essoreuse à plaques.
Sur l’écran tactile du générateur automatique de gouttelettes, sélectionnez les colonnes de la carte des plaques contenant les échantillons. Le pont de l’instrument s’allume pour indiquer quels consommables sont nécessaires. Chargez le générateur de gouttelettes de l’arrière vers l’avant.
Le voyant jaune passera du jaune au vert pour indiquer la suffisance des consommables. Placez un bloc froid et le porte-plaque de gouttelettes. Assurez-vous que le bloc est entièrement de couleur bleue et qu’aucun rose n’est visible.
Placez une nouvelle plaque ddPCR à 96 soudures dans le bloc froid. Placez la plaque PCR préparée dans le porte-plaque d’échantillonnage. Fermez le couvercle de la machine et appuyez sur Démarrer pour générer des gouttelettes.
Dans les 30 minutes, retirez la plaque contenant les gouttelettes du bloc froid. Ajoutez un joint en aluminium perçable à la plaque et placez la plaque dans le scellant de plaque. Scellez-le pendant cinq secondes à 180 degrés Celsius.
Placez ensuite la plaque dans un thermocycleur compatible et entrez les conditions de cyclage affichées à l’écran. Chargez la plaque dans le lecteur de gouttelettes en vous assurant qu’il reste suffisamment d’huile de lecture et que le conteneur à déchets dispose de suffisamment d’espace. Enfin, appuyez sur le bouton de lecture du logiciel pour commencer à lire les gouttelettes.
Une moyenne intra-essai pour chaque concentration dans chaque essai a été calculée et elle a été utilisée pour évaluer la précision et l’exactitude du test. Une précision inter-essais moyenne de 7,7% et une précision inter-essais absolue moyenne de 4,2% ont été trouvées pour tous les niveaux de CQ. L’exactitude et la précision entre les essais ont également été calculées à l’aide de la moyenne inter-essais de chaque niveau de CQ dans chaque lot.
Une précision inter-essais allant de 4 à 8,5 % et une précision absolue entre les essais allant de un à 3,2 % ont été trouvées. De même, pour l’échantillon lacrymal, une précision inter-essais moyenne de 3,7 % au niveau de pointe élevé et de 12,2 % au niveau de pointe faible et une précision absolue moyenne entre les essais de 11,3 % au niveau élevé et de 8,1 % au niveau bas ont été observées. Dans le cas du calcul inter-essais, on a constaté une précision de 5,5 % au niveau élevé et de 7,1 % au niveau bas et une précision absolue de 11,3 % au niveau élevé et de 8,1 % au niveau bas.
