Pour commencer, préparez l’équipement en allumant le respiromètre haute résolution et connectez-le au logiciel de respirométrie VatLab pour l’acquisition et l’analyse des données. Remplacez l’éthanol à 70 % dans la chambre d’oxygraphe par de l’eau distillée double. À l’aide d’une barre d’agitation magnétique, remuez-le continuellement à 750 tr/min dans la chambre.
Laissez reposer pendant 10 minutes, puis aspirez l’eau. Lavez la chambre trois fois avec de l’eau distillée double pendant cinq minutes chacune. Pour calibrer les capteurs d’oxygène, retirez d’abord l’eau distillée double et pipetez deux millilitres de milieu de préparation cellulaire dans la chambre.
Placez les bouchons en laissant une bulle d’échange d’air. Pour enregistrer les valeurs d’étalonnage de l’oxygène, ajustez les paramètres tels que le gain du capteur, la tension de polarisation et l’intervalle d’enregistrement des données. Étiquetez ensuite l’expérience et entrez le support.
Cliquez sur la mise en page et sélectionnez 01 Expérience d’étalonnage GR3 Temp. Remuez le fluide avec la barre d’agitation à 750 tr/min pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius et surveillez les performances de la membrane du capteur. En maintenant le bouton gauche de la souris et la touche Maj enfoncés, faites glisser la souris pour sélectionner une zone où le changement de concentration en oxygène est stable.
Cliquez ensuite sur oxygraphe, puis sur Étalonnage de l’O2. Lors de l’étalonnage de l’air, remplacez le repère sélectionné par la région sélectionnée précédemment. Cliquez ensuite sur calibrer et copier dans le presse-papiers.
Arrêtez l’enregistrement et sauvegardez en cliquant sur oxygraphe. Suivi de OK Contrôle, puis enregistrez et déconnectez-vous. Ensuite, pour effectuer une évaluation respiratoire, ouvrez la chambre et aspirez le milieu à l’intérieur.
Chargez les spermatozoïdes dans un volume final de deux millilitres de MRM pour l’analyse des cellules perméabilisées. Chargez l’étalonnage en double-cliquant sur la case d’étalonnage POS dans le coin inférieur et en ouvrant l’étalonnage effectué précédemment. Ensuite, arrêtez l’expérience.
Injectez 4,5 microlitres de digitonine de 10 millimolaires et perméabilisez les cellules pendant cinq minutes. Enregistrez la respiration des cellules intactes pendant au moins cinq minutes jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Ajoutez ensuite les substrats pour le complexe I ou le complexe II.Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise.
Ensuite, injectez cinq microlitres d’ADP de 0,5 molaire et mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise. Ajoutez un microlitre de quatre milligrammes par millilitre d’oligomycine, qui est un inhibiteur de l’ATP synthétase. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal diminue et se stabilise.
Titrer en ajoutant un microlitre de FCCP par étapes successives, en commençant par 0,1 millimolaire à un millimolaire jusqu’à ce qu’une fréquence respiratoire maximale non couplée soit atteinte. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal augmente et se stabilise. Arrêtez d’injecter le médicament lorsque la consommation d’oxygène commence à diminuer.
Enfin, injectez un microlitre de roténone millimolaire pour le complexe I ou cinq millimolaires d’antimycine A pour le complexe II afin de discriminer entre la consommation mitochondriale et la consommation résiduelle d’oxygène. Mesurez la consommation d’oxygène jusqu’à ce que le signal diminue et se stabilise. Pour effectuer une analyse des données, sélectionnez les régions où le flux d’oxygène par volume corrélé est stable après l’injection d’un substrat ou d’un inhibiteur, cliquez sur les marques, puis sur les fenêtres de statistiques, et exportez les données.
Normalisez les données obtenues pour 1 million de spermatozoïdes et soustrayez la consommation d’oxygène non mitochondrial de toutes les valeurs. Calculez les indices à l’aide de ces équations. L’enregistrement réussi de spermatozoïdes intacts à partir d’un échantillon de sperme a été réalisé où la ligne bleue indiquait la concentration d’oxygène et la ligne rouge représentait le débit d’oxygène par volume corrélé.
Un nombre plus faible de spermatozoïdes a entraîné une consommation d’oxygène de base plus faible. De plus, des courbes de consommation d’oxygène spécifiques pour le complexe mitochondrial I ou le complexe II ont été obtenues à l’aide de ce protocole.
