Pour commencer, décongelez rapidement un stock congelé de cellules SH-SY5Y dans FBS. Complété avec 10% de DMSO et dilué dix fois avec un média préchauffé. Ensuite, centrifugez les cellules et retirez le surnageant.
Remettre en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieux préchauffés et de cellules de semence dans un flacon T25. Pour préparer les lamelles recouvertes de PDL, appliquer 600 microlitres de solution PDL à 50 microgrammes par millilitre sur chaque puits de lamelles de couverture à chambre stérile. Le volume de PDL ajouté à chaque puits varie en fonction de la taille du puits.
Incubez les lamelles, réglez la température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, retirez la solution PDL et rincez la lamelle trois fois avec 1,8 millilitre d’eau distillée. Laissez la chambre revêtue sécher à l’air libre pendant deux heures.
Une fois que les cellules SH-SY5Y atteignent 80 à 90% de confluence, dissociez-les en ajoutant une solution de trypsine. Neutralisez la trypsine en ajoutant un milieu DMEM préchauffé. Centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans du DMEM.
Comptez les cellules sur un compteur de cellules automatisé. Ensuite, ensemencez les cellules à une densité de 1,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre carré sur le verre de couverture chambré à revêtement PDL. Le premier et le troisième jour, remplacez le milieu par du DMEM complété par cinq ou 2 % de FBS respectivement, 1 % d’antibiotique antimycosique et 10 micromolaires de RA ou 95 % d’éthanol du même volume d’additif pour servir de contrôle du véhicule pour la différenciation.
Préparez un bouillon PKMO dans du DMEM libre au rouge de phényle préchauffé complété par deux ou 10 % de FBS en fonction de l’état de différenciation, 1 % d’antibiotique antimycosique et 20 millimolaires de hepes. Le sixième jour, rincez les cellules deux fois avec un milieu d’imagerie et incubez les cellules avec la solution PKMO à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après la coloration, rincez les cellules trois fois avec un milieu d’imagerie préchauffé.
Pour le lavage final, incubez les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, remplacez le lavage final par un milieu d’imagerie frais préchauffé contenant 20 millimolaires de hepes.
