Commencez par pipeter une goutte de solution de blocage prête à l’emploi avec du sérum d’ânesse sur les échantillons de tissus. Incubez ensuite les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez l’excès de solution de blocage des lames en tapotant le bord contre une surface dure.
Diluer les anticorps primaires dans le tampon de dilution d’anticorps pour préparer 100 microlitres de la solution finale pour chaque échantillon. Mettez en place les anticorps, un tube pour chaque anticorps primaire et un pour chaque anticorps isocontrol. Répartir uniformément 100 microlitres d’anticorps isocontrol dans un échantillon et 100 microlitres de myéloperoxydase et d’histone H3 citrulliée, ou dilution d’anticorps myéloperoxydase et neutrophile élastase dans l’autre échantillon.
Placez les lames dans une chambre humide et conservez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, prélevez l’excédent de solution d’anticorps primaire des lames et empilez-les dans une cuvette. Rincez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune à l’aide d’une solution saline tamponnée Tris avec une interpolation Pour éliminer la solution d’anticorps primaire restante.
Préparez deux anticorps secondaires distinctement fluorescents, l’anticorps anti-chèvre pour la myéloperoxydase et l’anticorps anti-lapin pour la coloration de l’histone H3 citrullinée. Diluez chaque anticorps à une concentration de 7,5 microgrammes par millilitre dans le tampon de dilution d’anticorps. Placez les lames dans une chambre humide et distribuez 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire sur chaque échantillon.
Incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Retirez l’excès de solution d’anticorps secondaire en tapotant les lames. Placez les diapositives dans un support à lames.
Immergez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans un bocal de coloration rempli de PBS pour éliminer les anticorps non liés. Préparez la solution dappy et diluez-la à une concentration d’un microgramme par millilitre avec de l’eau déminéralisée. Immergez la grille à lames dans un bocal de coloration contenant la solution de teinture et incubez pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Ensuite, immergez la grille à lames dans un bocal de teinture avec du PBS pendant cinq minutes pour éliminer tout excès de solution tachetée. Enfin, montez les échantillons à l’aide de lamelles et de support de montage. L’anticorps de l’histone H3 citrullinée ne s’est lié qu’aux histones extracellulaires et n’a montré aucune coloration des histones intracellulaires.
L’anticorps spécifique à la myéloperoxydase humaine ou à la souris n’a montré aucune coloration spécifique. Alors que les anticorps universels de l’homme et de la souris ont montré une bonne coloration constante pour la myéloperoxydase. Lorsqu’aucun agent bloquant n’a été utilisé, certains échantillons de souris ont montré une coloration positive plus non spécifique et partielle.
Lorsqu’il est bloqué, le temps de blocage de cinq minutes a donné de bons résultats par rapport au temps de blocage de 10 minutes. Les températures plus élevées dans le micro-ondes et le bain-marie ont montré une récupération d’antigène constamment modérée à bonne. Alors que dans un bain-marie à 60 degrés Celsius, il n’y avait que partiellement une coloration positive ou nulle.
Pour la double coloration, des résultats plus favorables ont été obtenus pour les échantillons incubés au bain-marie à 96 degrés Celsius. Cependant, le dépassement du temps d’incubation de 40 minutes à 96 degrés Celsius a entraîné une coloration moins intense des anticorps.
