Pour commencer, centrifugez le FBS pendant la nuit dans une ultracentrifugeuse à 110 000 G et à quatre degrés Celsius pour éliminer les sEV endogènes. Stérilisez le surnageant en le filtrant à travers une membrane d’ultrafiltration de 0,2 micron pour obtenir un FBS sans sEV. Ensuite, dans une boîte de culture de 150 millimètres, plaquer environ 3 fois 10 à la septième macrophages immortalisés dérivés de la moelle osseuse dans 20 millilitres de milieu de culture DMEM.
Incubez le plat à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit avant de prélever les sEV des macrophages. Le lendemain, après avoir jeté le milieu, lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate ou du PBS. Remplacez le milieu par du DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal libre sans sEVs avant d’incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Sur la base des exigences de l’expérience, collecter et transférer le surnageant des cellules dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres. Centrifugez les tubes à 300 G pendant 10 minutes pour retirer les cellules. Transférez le résultat en surnageant de chaque tube dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres et jetez la pastille.
Cette fois, centrifugez le surnageant à 2000 G pendant 10 minutes pour éliminer les cellules mortes. Transférez ensuite le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger à grande vitesse et jetez les granulés. Ensuite, pour éliminer les débris et les microvésicules, centrifugez le surnageant obtenu à 10 000 G pendant 30 minutes à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse.
Transférez le surnageant obtenu dans de nouveaux tubes d’ultracentrifugation en ajoutant 35 millilitres dans chaque tube et en jetant les pastilles. Centrifuger les tubes d’ultracentrifugation dans une centrifugeuse à rotor à godets oscillants à 110 000 G pendant 70 minutes avant de jeter le surnageant. Lavez la pastille brute enrichie en sEV obtenue avec un millilitre de PBS.
Encore une fois, ajoutez un millilitre de PBS à la pastille lavée dans l’un des tubes et mélangez en pipetant en continu. Transférez le millilitre de suspension de PBS résultante dans un autre tube contenant la pastille et répétez la même chose jusqu’à ce que toutes les pastilles dans les tubes soient mélangées par pipetage. Transférez le millilitre de PBS riche en sEV résultant dans un nouveau tube d’ultracentrifugation.
Centrifugez ensuite le nouveau tube dans une ultracentrifugeuse de table à 110 000 G pendant 70 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, lavez la pastille brute enrichie en sEV obtenue avec 100 microlitres de PBS. Ajoutez 1,2 millilitre de solution de préparation de protéines dans un tube de protéines standard pour dissoudre les 30 milligrammes de BSA qui y sont présents.
Diluez la solution étalon de protéines obtenue avec du PBS pour réduire sa concentration de 25 à 0,5 milligramme par millilitre. Ajouter huit volumes différents de la solution étalon de protéines diluées dans les puits d’une plaque à 96 puits, et porter le volume à 20 microlitres dans chaque puits à l’aide de PBB. Ajouter 18 microlitres de tampon de lyse HEPES dans les puits d’échantillons, puis ajouter deux microlitres d’échantillons de sEVs.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de travail BCA préparée selon les instructions du fabricant dans chaque puits. Laisser reposer l’assiette à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Enfin, mesurez l’absorbance à 562 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques.
Calculer la teneur totale en protéines des sEV à l’aide des résultats obtenus. Les images de microscopie électronique à transmission des sEV isolés ont montré une morphologie typique en forme de coupe. L’analyse de suivi des nanoparticules a montré que les sEV isolés étaient principalement concentrés à 136 nanomètres.
Le transfert Western a montré que les sEV isolés étaient significativement enrichis en marqueurs sEVs, y compris CD9, bêta-actine et TSG101. Le marqueur réticulé endoplasmique GRP94 n’a été détecté que dans le lysat de cellules entières. Les résultats ont indiqué que la méthode employée a permis d’obtenir des sEV d’un haut niveau de pureté.
