Pour commencer, lavez les petites vésicules extracellulaires isolées ou SEV deux fois par ultracentrifugation à 110 000 G et quatre degrés Celsius pendant 70 minutes. Remettre les vésicules en suspension dans 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ensuite, ajoutez-y cinq microlitres d’inhibiteur de protéase 100X.
Soumettre l’échantillon à un écrasement par ultrasons à 40 watts pendant 10 minutes, avec un temps ultrasonique de trois secondes et un intervalle de cinq secondes. Centrifuger le mélange broyé à 13 700 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Au surnageant obtenu, ajouter le dithiothréitol jusqu’à une concentration finale de 50 millimolaires.
Et incubez-le au bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’iodoacétamide d’une molaire au surnageant. Et laissez-le réagir à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité.
Centrifugez le mélange à 13,700 G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Et transférez le surnageant contenant l’extrait peptidique brut dans un tube d’ultracentrifugation de 10 kilodaltons. Éliminez les protéines du peptide brut en centrifugeant le tube d’ultrafiltration à 13 700 g et quatre degrés Celsius pendant une heure.
Séchez l’effluent collecté dans un concentrateur centrifuge sous vide à 45 degrés Celsius. Pour le dessalage, utilisez de l’eau pure de qualité spectrométrie de masse comme solvant pour tous les réactifs. Tout d’abord, dissolvez les peptides secs dans 100 microlitres d’acide trifluoracétique à 0,1 % ou TFA, et gardez-les de côté.
Ajoutez ensuite 100 microlitres d’acétonitrile pur dans chaque colonne de dessalage. Centrifuger les colonnes à 400 G pendant trois minutes à température ambiante et jeter l’effluent. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’acétonitrile à 50 % par colonne de dessalage, et répétez la centrifugation comme mentionné précédemment avant de jeter l’effluent.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 0,1 % d’AFT à chaque colonne de dessalage avant de centrifuger comme mentionné précédemment. Encore une fois, jetez l’effluent. Maintenant, pipetez les peptides de dessalage dans la colonne de dessalage.
Centrifugez les colonnes comme mentionné précédemment pour charger l’échantillon. Remettre l’effluent récupéré dans la colonne de dessalage pour répéter le chargement. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 0,1% TFA.
Centrifugez comme mentionné précédemment, et jetez l’effluent. Enfin, ajoutez 50 microlitres d’acétonitrile à 50 % contenant 0,1 % d’AGT au peptide dans la colonne de dessalage. Après centrifusion, comme mentionné précédemment, collectez l’effluent dans un nouveau tube à centrifuger de qualité spectrométrie de masse.
