Pour commencer, préparez 10 à 20 microgrammes d’ARN total de haute qualité pour l’isolement de l’ARN enrichi en poly(A). Transférez une aliquote d’ARN dans un tube à microcentrifuger sans nucléase de 1,5 millilitre. Incubez le tube dans un bloc chauffant à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis placez-le sur de la glace pendant deux minutes.
Après avoir remis en suspension les billes oligo(dT), transférez le volume requis de suspension de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et placez-le sur l’aimant pendant trois minutes jusqu’à ce que les billes magnétiques forment une pastille. Retirez le surnageant et ajoutez un volume égal de tampon de lyse. Remettre les perles en suspension.
Replacez le tube sur l’aimant pendant trois minutes et retirez le surnageant. Pour le premier cycle de purification, ajoutez un tampon de lyse dans le tube d’échantillon d’ARN et mélangez soigneusement. Transférez ensuite le mélange dans les billes d’oligo(dT) et remettez en suspension au moins 10 fois le pipetage complet.
Laisser les échantillons incuber avec une rotation continue à température ambiante. Après 15 minutes, placez l’échantillon sur un aimant pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Jeter le surnageant.
Ajoutez 600 microlitres de tampon de lavage un aux billes et mélangez soigneusement pour remettre en suspension. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage deux aux billes et mélangez soigneusement pour remettre en suspension. Placez le tube sur l’aimant pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
Jeter le surnageant. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de tris HCL froid de 10 millimolaires dans le tube d’échantillon et incubez à 70 degrés Celsius. Au bout de cinq minutes, transférez rapidement le tube sur l’aimant.
Et lorsque la suspension est claire, transvasez le surnageant contenant l’ARN enrichi en poly(A) élué dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pour le deuxième cycle de purification, ajoutez 120 microlitres de tampon de lyse à l’échantillon d’ARN élué et mélangez soigneusement. Lavez les billes utilisées lors du premier cycle de purification avec un volume égal de tampon de lyse.
Pipeter 10 fois pour remettre les billes en suspension, puis placer le tube sur l’aimant pendant cinq minutes avant de jeter le surnageant. Transférez le mélange tampon de lyse de l’ARN sur les billes lavées et mélangez soigneusement par pipetage. Après avoir lavé les billes comme démontré précédemment, ajoutez 25 microlitres de tris HCL froid de 10 millimolaires dans le tube d’échantillon et incubez à 70 degrés Celsius.
Au bout de cinq minutes, transférez rapidement le tube dans l’aimant et, lorsque la suspension est claire, transférez le surnageant contenant de l’ARN enrichi en poly(a) élué dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, pour la conversion au bisulfite, transférez 19 microlitres d’échantillon d’ARN enrichi en poly(A) purifié dans un tube à huit bandelettes de 0,2 millilitre et ajoutez un microlitre de contrôle de la piqûre au rapport de quantité prédéterminé de un à 10 000. Après avoir ajouté 130 microlitres de réactif de conversion dans les tubes et bien mélangé, placez le tube dans la machine PCR et démarrez le programme PCR.
Après la PCR, placez la colonne sur le tube de prélèvement et ajoutez 250 microlitres de tampon de liaison à l’ARN dans la colonne. Transférez ensuite 150 microlitres d’échantillon traité au bisulfite dans la colonne et pipetez soigneusement. Ajoutez 400 microlitres d’éthanol à 95 à 100% dans la colonne, fermez rapidement le bouchon et inversez plusieurs fois.
Après une centrifugation, un lavage et une neutralisation répétés avec un tampon de désulfonation, transférez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 20 à 30 microlitres d’eau sans nucléase dans la colonne et laissez-la reposer pendant une minute. Centrifuger à 10 000 g pendant 30 secondes à 25 degrés Celsius et transférer 2,2 microlitres de surnageant dans huit tubes à bandelettes pour évaluer la quantité et la qualité de l’ARN.
L’efficacité de l’enrichissement en poly(A)ARN a été évaluée par un test d’ARN total par électrophorèse capillaire, ce qui a entraîné une diminution de la contamination par ARN ribosomique après double purification dans des lignées cellulaires de cancer du pancréas. La quantité d’ARN avant et après le traitement au bisulfite a été évaluée par électrophorèse capillaire. Après le traitement au bisulfite, la distribution de la taille de l’ARN a montré un pic de 200 à 500 nucléotides en raison de la fragmentation causée par la réaction au bisulfite.
L’électrophorèse capillaire de l’amplicon a montré une préparation réussie de la bibliothèque avec un minimum d’amorce restante et aucun pic de suramplification. Après l’alignement des lectures de séquençage sur la séquence de référence, la moyenne de 2 440 lectures totales a été mappée à la séquence de pics, et le taux de conversion total de C en T analysé a atteint une moyenne de 99,81 %
