Pour commencer, décongelez le stock de rétrovirus RCAS(A) sur de la glace. Pour éviter d’obstruer la micropipette, centrifuger la solution à 10 000 G pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube tout en gardant les solutions sur la glace. Placez un parafilm de laboratoire étiré sur une boîte de culture cellulaire de 35 x 10 millimètres et ajoutez un microlitre de PBS stérile au parafilm.
Connectez une micropipette en verre préparée à un injecteur automatique Pico. Appuyez sur le mode de remplissage pour remplir le PBS dans une micropipette, puis appuyez sur le mode d’injection pour tester le microlitre de liquide alloué. Placez un deuxième morceau de parafilm de laboratoire étiré sur une nouvelle boîte de culture cellulaire et ajoutez un microlitre de bouillon viral coloré vert rapide au film.
Abaissez l’extrémité de la micropipette dans le bouillon viral et appuyez sur le mode de remplissage pour remplir la micropipette avec un microlitre de stock viral. Sous un microscope à dissection, abaissez la micropipette remplie reliée à un injecteur automatique dans la région cible du cristallin de l’embryon de poulet. Ajustez ensuite la source lumineuse pour offrir une vue claire de la vésicule du cristallin.
Après vous être assuré que la micropipette se trouve au bon endroit à l’intérieur de la lumière de la lentille, injectez cinq à 40 nanolitres de stock viral. Après l’injection, attendez 45 secondes avant de retirer délicatement la micropipette. Ensuite, vérifiez la réussite de la micro-injection en examinant le colorant vert rapide dans la lumière vide de la lentille sans fuite.
Après examen, scellez l’ouverture de la coquille d’œuf avec du ruban adhésif et placez les œufs dans un incubateur statique humidifié à 37 degrés Celsius. Cette étude démontre l’évaluation histologique des boucles chimériques connexon 50 et 43 par immunofluorescence. À l’aide de l’étiquetage Anti-Flag, les connexons exogènes ont été distingués des connecteurs endogènes.
L’étude évalue également l’interaction entre le domaine de la boucle intracellulaire du connexon 50 et l’aquaporine zéro.
