Pour commencer, placez la puce et le support de puce dans le support de puce situé dans une boîte de culture tissulaire stérile et gardez-le de côté dans la hotte de culture tissulaire pendant la préparation du réactif d’activation de la puce. Ajouter un millilitre de solution de CR2 dans le flacon contenant de la poudre de CR1. Transférez la solution du flacon dans un tube de 15 millilitres enveloppé dans du papier d’aluminium.
Répétez ce processus jusqu’à ce que quatre rinçages et quatre millilitres de CR2 aient été rincés dans le flacon de CR1. Pour le dernier rinçage, bouchez le flacon et retournez-le pour éliminer les résidus de poudre. Ensuite, ajoutez six millilitres de CR2 dans le tube de 15 millilitres contenant CR1.
Mélangez la solution finale de 10 millilitres à l’aide d’une pipette sans introduire de bulles. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, ajoutez 20 microlitres de solution CR1 à l’entrée du canal inférieur de la puce jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal inférieur. Ajouter 50 microlitres de solution CR1 par l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal supérieur.
Ensuite, placez les chips sous la lumière ultraviolette pendant 15 minutes. Après l’exposition, retirez toute solution CR1 des canaux supérieur et inférieur. Lavez les deux canaux avec 100 microlitres de solution CR2.
Ensuite, lavez deux fois avec 100 microlitres de DPBS. Préparez les solutions de matrice extracellulaire pour les canaux supérieur et inférieur de la puce. Ajouter 50 microlitres de solution de matrice extracellulaire à l’entrée du canal inférieur jusqu’à ce que la goutte apparaisse à la sortie.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres à l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce que la goutte apparaisse sur l’entrée. Ajoutez le DPBS dans le réservoir du support de puce. Placez le couvercle sur l’assiette et incubez les chips pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone incubateur.
Le lendemain, rincez l’épithélium ou le canal supérieur de la puce avec 100 microlitres de milieu d’expansion de puce préchauffé. Ensuite, rincez l’endothélium ou le canal inférieur avec 100 microlitres de milieu HIMEC préchauffé. Après le comptage, ajoutez 10 microlitres d’HIMECs dans le canal endothélial.
Si nécessaire, ajouter un milieu de croissance organoïde ou un milieu d’expansion à puce dans le canal épithélial et vérifier la densité de semis des HIMEC. Ensuite, inversez la puce dans le berceau de la puce placé dans la boîte de culture cellulaire, ajoutez le DPBS dans le réservoir du berceau de la puce et placez la puce à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures pour permettre aux HIMEC de se fixer à la membrane de la puce. Après l’incubation, remettez le support de copeaux en position verticale.
Lavez délicatement le canal endothélial avec 100 microlitres de milieu HIMEC chaud et le canal épithélial avec un milieu de croissance organoïde ou un milieu d’expansion de puce, en laissant le milieu dans le canal. Pour la récolte des entéroïdes, aspirez doucement le milieu et lavez les puits contenant l’hydrogel de matrice de culture cellulaire avec 500 microlitres de DPBS chaud. Ajoutez 250 microlitres de solution de récupération de cellules froides dans chaque puits et grattez le fond de chaque puits avec une pointe de pipette neuve pour perturber l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire.
Ajouter la suspension cellulaire perturbée dans un tube froid de 15 millilitres sur de la glace et incuber pendant 45 minutes. Après incubation, centrifugez la suspension et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de dissociation entéroïde chaud à la pastille et placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.
Pendant 60 à 120 secondes, ajoutez ensuite 10 millilitres de produit de lavage à froid dans le tube. Ensuite, centrifugez et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de fluide d’expansion à copeaux. À l’aide d’une pipette P200, dissociez les entéroïdes et ajoutez la suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Comptez les cellules et ajustez le volume du support d’expansion des puces pour obtenir une concentration de six fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de suspension cellulaire remise en suspension dans le canal supérieur de la puce. Après avoir remis les copeaux dans le berceau de la puce, ajoutez le DPBS dans le réservoir et incubez les copeaux pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, rincez deux fois le canal épithélial avec 100 microlitres de média d’expansion de puce et le canal endothélial avec 100 microlitres de milieu HIMEC. Ensuite, ajoutez deux millilitres de produit d’expansion de copeaux dans le réservoir d’entrée du canal supérieur et 300 microlitres dans le réservoir de sortie du canal supérieur. Ajouter deux millilitres de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur et 300 microlitres dans le réservoir de sortie du canal inférieur.
Amorcez les gousses et ajoutez les copeaux aux gousses. Ajoutez ensuite les gousses au module de culture. Réglez un débit de 30 microlitres par heure et lancez le cycle.
Les cellules épithéliales intestinales cultivées à l’aide de l’intestin néonatal sur une puce ont formé une monocouche de cellules confluentes, puis se sont développées en une structure tridimensionnelle mature ressemblant à des villosités. L’ajout d’un microbiome dysbiotique d’un nouveau-né atteint d’entérocolite nécrosante sévère à l’intestin néonatal sur un modèle de puce a montré une expression accrue du TNF-alpha par rapport au témoin.
