Pour commencer, prenez un millilitre d’une culture de cellules de levure bourgeonnante en phase milogarithmique, exprimant HyPer7 ciblant les mitochondries. Centrifuger les cellules à 6 000 G pendant 30 secondes et retirer le surnageant, en laissant 10 à 20 microlitres dans le tube. Remettre en suspension la pastille cellulaire en la mélangeant doucement avec le milieu résiduel à l’aide d’une micro-pipette.
Ensuite, utilisez un souffleur d’air ou un mouchoir non pelucheux pour nettoyer une lame de microscope en verre et ajoutez 1,8 microlitre de suspension cellulaire à la lame. Enfin, recouvrez les cellules avec la lamelle de verre numéro 1,5 en l’abaissant lentement à un angle pour éviter d’introduire des bulles. Placez ensuite la lame sur la platine du microscope.
Pour imager les cellules, configurez les conditions d’acquisition afin d’assurer un signal détectable et une résolution acceptable dans chaque canal de fluorescence. Par exemple, sur un microscope confocal à disque rotatif avec une caméra sCMOS, utilisez un binning 2x2, une puissance laser de 20 à 40 % et une exposition de 200 à 600 millisecondes. Ensuite, examinez l’histogramme de l’image.
Dans une image 12 bits, assurez-vous que la plage dynamique totale des valeurs de pixel est d’au moins plusieurs centaines de niveaux de gris sans saturation. De plus, assurez-vous que la plage est supérieure d’un ordre de grandeur au niveau de bruit. Pour calculer le niveau de bruit, mesurez l’écart type des valeurs de pixel dans une zone sans cellule d’une image.
Collectez ensuite des images en accéléré sans délai entre les acquisitions pour évaluer les effets des conditions d’imagerie sur la stabilité du signal et le stress oxydatif dans les mitochondries. À l’aide du logiciel d’acquisition au microscope ou d’ImageJ, mesurez la valeur moyenne des pixels dans chaque canal de fluorescence pour assurer la stabilité du signal. Si l’expérience n’implique pas d’imagerie en accéléré, assurez-vous que la fluorescence est stable sur deux ou trois empilements Z répétés.
Acquérez des images avec un intervalle Z de 0,5 micromètre dans une profondeur totale de pile de six micromètres pour la levure bourgeonnante. Si vous collectez des piles Z, assurez-vous que l’intervalle Z est le même pour toutes les images du jeu de données et incluez la cellule entière. Acquérez également des images en lumière transmise pour documenter les limites des cellules.
