Pour commencer, ouvrez une image de pile Z multicanal aux Fidji et ouvrez le fichier de script d’analyse de biocapteur souhaité. Cliquez sur Exécuter dans la fenêtre de l’éditeur de script pour exécuter le script. Saisissez ensuite les informations demandées dans la fenêtre de dialogue qui s’affiche.
Sélectionnez les numéros de canal du numérateur et du dénominateur pour le calcul du rapport. Pour les mitochondries ciblées HyPer7, le numérateur est le canal excité à 488 nanomètres et le dénominateur est le canal excité à 405 nanomètres. Sélectionnez le numéro de canal de l’image de lumière transmise s’il est présent, ou zéro s’il n’y en a pas.
Choisissez ensuite la méthode de soustraction d’arrière-plan souhaitée. Si l’arrière-plan est uniforme, cliquez sur Sélectionner une zone de l’image pour mesurer le niveau d’arrière-plan de l’image. Ensuite, choisissez la méthode de soustraction de bruit souhaitée pour réduire la variation aléatoire dans la lecture du détecteur.
Cliquez sur Sélectionner une zone d’image. Sélectionnez l’option de valeur fixe pour entrer un niveau de bruit précédemment mesuré, ce qui fonctionne généralement bien si les conditions d’imagerie sont maintenues constantes. Pour une détection précise et cohérente des mitochondries, sélectionnez un algorithme de seuillage tel que Otsu ou Entropie maximale.
Utilisez le même algorithme pour toutes les images d’une expérience, mais assurez-vous que les mitochondries sont reconnues avec précision. Sélectionnez ensuite le nombre de régions d’intérêt par cellule. Par exemple, si vous mesurez les différences entre les bourgeons mères, sélectionnez-en deux.
Sélectionnez le dossier de sortie dans lequel les images de mesures et de rapport seront enregistrées. Pour la correction de l’arrière-plan ou du bruit, choisissez Sélectionner une zone d’image. Suivez les invites pour dessiner une zone d’arrière-plan à l’aide de l’outil ROI rectangulaire et cliquez sur OK.
Lors de l’analyse de cellules individuelles ou de régions subcellulaires, dessinez les régions d’intérêt en fonction de l’image en fond clair. Le retour sur investissement n’a pas besoin de correspondre précisément au contour de la cellule, car seules les mitochondries seuillées dans le retour sur investissement seront mesurées. Après avoir créé chaque ROI, appuyez sur T pour ajouter le ROI sélectionné au gestionnaire de ROI.
Cochez la case Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement pour documenter les cellules marquées. Chaque région ajoutée apparaîtra sous la forme d’un élément numéroté dans la liste ROI Manager. Si vous analysez plus d’un retour sur investissement par cellule, marquez les retours sur investissement dans le même ordre pour chaque cellule analysée.
Une fois que tous les ROI souhaités ont été ajoutés au gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur OK dans la fenêtre de dialogue Marquer les cellules. Ensuite, sélectionnez le format de la table de mesure. Dans la boîte de dialogue Multi-mesures, cochez les options Mesurer toutes les tranches et Une ligne par tranche pour produire un tableau avec le format souhaité.
Utilisez les tables de multi-ROI du processus. rscript pour traiter les tables créées avec l’option one-row-per-slice. Ne cochez pas l’option append-results.
Enregistrez les fichiers de sortie dans le dossier sélectionné à l’aide du script. Ouvrez maintenant l’image de la pile de rapport Z aux Fidji pour générer une image de rapport colorisée. Ouvrez ensuite le colorize_ratio_image.
ijm et cliquez sur Exécuter dans la fenêtre de l’éditeur de script. Une fenêtre de dialogue vous invitant à saisir les informations demandées apparaîtra. Dans l’option non modulée, tous les pixels mitochondriaux apparaissent à la même luminosité.
Certaines images peuvent sembler bruitées, car des pixels sombres et lumineux contribuent au rapport de l’image. Utilisez l’option de modulation d’intensité pour réduire le bruit. Dans la méthode des valeurs minimales et maximales affichées, choisissez des valeurs proches des valeurs minimales et maximales moyennes observées dans un test.
Pour assurer la cohérence, acquérez toutes les images en utilisant les mêmes conditions d’imagerie et affichez toutes les images en utilisant les mêmes valeurs minimales et maximales. Sélectionnez ensuite le mode de projection pour projeter la pile Z et afficher l’ensemble de la population mitochondriale avant la colorisation. Pour une projection d’intensité maximale, sélectionnez maximum.
Pour créer une projection d’intensité moyenne, sélectionnez moyenne. Enfin, sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer les images colorisées. Si l’option non modulée est sélectionnée, choisissez une combinaison de couleurs dans la fenêtre de dialogue qui s’affiche.
Utilisez les tables de correspondance RVB feu ou arc-en-ciel intégrées à Fidji ou toute autre table de correspondance souhaitée au format LUT d’ImageJ. Utilisez le script pour enregistrer les fichiers de sortie dans le dossier sélectionné. Le rapport réduit oxydé des mitochondries marquées HyPer7 a montré une réponse dose-dépendante à la concentration de peroxyde d’hydrogène, qui a atteint un plateau à une à deux millimolaires de peroxyde d’hydrogène ajouté à l’extérieur.
Des différences dans le peroxyde d’hydrogène mitochondrial ont été observées dans les cellules de levure. Une diminution statistiquement significative de la lecture du biocapteur de peroxyde d’hydrogène a été détectée dans les mitochondries du bourgeon par rapport à la cellule mère.
