Le jour zéro, plaquez 10 millions de cellules 293T dans 30 millilitres de DMEM sans antibiotiques contenant 10% de FBS dans une boîte de 15 centimètres. Préparez un total de 10 plats de ce type. Le lendemain, c’est-à-dire le premier jour, confirmez que les cellules sont confluentes à 80 % et prêtes pour la transfection.
Ensuite, dans un tube conique de 50 millilitres séquentiellement, ajoutez 600 microlitres de 0,5 microgramme par microlitre de mélange plasmidique d’emballage et une bibliothèque de codes-barres plasmides de 60 microlitres. Dans un tube conique séparé de 15 millilitres, mélangez 900 microlitres de réactif de transfection et 12 millilitres de DMEM par vortex. Ajoutez 12,9 millilitres de ce mélange au mélange d’ADN et effleurez simplement pour combiner.
Sans mélanger davantage, incubez le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres du mélange incubé dans chaque boîte de 15 centimètres contenant les cellules 293T et incubez les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Le troisième jour, récoltez le virus en faisant passer le milieu à travers une unité de filtration de 0,2 micron.
Aliquote le filtrat contenant les particules virales dans des tubes coniques de 15 millilitres. De plus, préparez cinq aliquotes d’un millilitre de virus filtré dans des flacons cryogéniques pour le titrage viral. Pour titrer les pools lentiviraux, ajoutez 65 microlitres de polymère cationique dans un flacon en verre stérile contenant 65 millilitres de milieu de croissance des cellules tumorales.
Pipeter un millilitre de milieu contenant le polymère par puits dans 11 plaques de culture tissulaire à six puits. Ensuite, trypsiniser les cellules tumorales à passage précoce. Après avoir compté les cellules à l’aide d’une méthode préférée, transférez les cellules dans les plaques à six puits.
Décongeler les aliquotes d’un millilitre du lentivirus de 48 heures du congélateur dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Suivez le tableau pour préparer l’infection pour chaque module viral.
