Commencez par retirer le milieu de stade II de la suspension cellulaire iPSC le septième jour de culture. Lavez maintenant les cellules avec deux millilitres de DPBS. Pipeter un millilitre de solution de décollement de cellules dans chaque puits.
Placez ensuite l’assiette dans un incubateur à 37 degrés pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu de stade II aux cellules et mélangez soigneusement jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la surface. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres, puis la centrifuger à 400 g pendant trois minutes à température ambiante.
Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu de stade III. Mélangez délicatement la solution. Maintenant, semez la suspension dans une plaque à six puits à faible adhérence dans un rapport de un à trois.
Placez la plaque sur un agitateur orbital dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Pour retirer le milieu dans la culture en suspension, coupez d’abord l’extrémité d’une pipette d’un millilitre à l’aide de ciseaux aseptiques. Agitez ensuite doucement la plaque à six puits pour centraliser les organoïdes.
Ensuite, aspirez les organoïdes avec les pipettes préparées et placez-les dans un tube de 15 millilitres, en les laissant reposer pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant en veillant à ce que les organoïdes restent à la base du tube. Pipetez ensuite le milieu de l’étape III dans la plaque.
Pipeter le mélange pour remettre les organoïdes en suspension. Replaquer les organoïdes dans une plaque à six puits à faible adhérence. Continuez à agiter la plaque à faible adhérence à 60 rotations par minute dans l’incubateur.
Le 12e jour, remplacez le milieu par un milieu de stade IV. Les organoïdes rénaux présentent des structures tubulaires et sont facilement observables sur les images en fond clair après 18 jours d’agrégation. Des cellules endothéliales CD31 ont été induites.
Le dextran a été absorbé dans les tubules proximaux des organoïdes rénaux.
