Pour commencer, fixez les membres d’une souris anesthésiée avec du ruban adhésif. Tenez la peau de l’abdomen vers le haut et coupez soigneusement le long de la circonférence du thorax pour l’exposer complètement. Faites une petite incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux ophtalmiques et insérez immédiatement une aiguille de perfusion de calibre 22 à l’apex du ventricule gauche.
Poussez ensuite 30 à 50 millilitres de liquide de perfusion cardiaque à travers la seringue. Une fois que le liquide d’écoulement de l’oreillette droite devient complètement clair, perfusez un volume égal de solution à 4 % de PFA. Disséquez les tissus et les organes et fixez-les pendant la nuit avec 4 % de PFA à quatre degrés Celsius.
Pour induire la décalcification des tissus. placer le tissu cardiaque fixe dans 10 millilitres de solution d’EDTA sur une table agitée à 37 degrés Celsius. Incubez pendant environ deux jours et changez le liquide tous les jours.
Placez les os calvaires fixes dans 20 millilitres de solution 25%Quadrol pour la décoloration des tissus. Incuber sur une table vibrante à 37 degrés Celsius pendant une journée et changer le liquide une fois. Ensuite, placez le tissu séquentiellement dans une solution de butanol tertiaire ou de tuberculose à 30 %.
Ensuite, une solution de 50 % de To, puis une solution de 70 % de To pour effectuer un dégraissage de gradient. Ensuite, déshydrater les échantillons et la solution de TB PEG pendant six heures sur une table agitée à 37 degrés Celsius. Enfin, placez le tissu complètement déshydraté dans une solution de BB PEG sur une table agitée à 37 degrés Celsius.
Après deux à quatre heures d’incubation, le tissu deviendra transparent. La méthode d’élimination des tissus PEGASOS a permis d’obtenir des tissus transparents. Les tissus nettoyés avec coloration EDU à montage entier ont montré que le marquage était efficace et bien conservé.
Dans le groupe témoin, plusieurs cellules positives de l’EDU étaient distribuées de manière diffuse dans les sutures. Après une journée d’expansion de la suture, des cellules proliférantes ont été observées au milieu et sur les bords de la suture. Au fur et à mesure que la suture s’élargissait, le nombre de cellules proliférantes diminuait avec le temps.
Les cellules marquées en vert étaient de petites cellules rondes dans la moelle osseuse, qui différaient des cellules de suture positives de l’EDU.
