Avant de plonger la congélation des grilles de microscopie électronique contenant les cellules, inspectez les grilles sous un microscope optique inversé. Enregistrez les densités de cellules sur chaque grille pour ajuster les temps de transfert pendant la congélation en plongée. Réchauffez deux à trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS dans une assiette vide à 37 degrés Celsius.
Pour la préparation des repères d’or, pipeter 50 microlitres de solution de billes d’or colloïdal de 10 nanomètres dans un tube propre de 1,5 millilitre. Ajoutez-y deux microlitres d’albumine sérique bovine et homogénéisez par micro-pipetage à plusieurs reprises. Centrifuger le tube à 15 000 à 20 000 G pendant 15 minutes.
Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille à l’aide d’une micro pipette. Remettre le granulé en suspension dans 50 microlitres de PBS et centrifuger à nouveau le tube, comme démontré précédemment. Aspirez quatre microlitres de granulés à l’aide d’une buse de 10 microlitres et transférez-les dans un tube propre de 1,5 millilitre.
Installez la chambre environnementale à 95% d’humidité et 30 degrés Celsius. À l’aide d’une pince à épiler de cinq x 15, sélectionnez une grille et lavez-la avec du PBS. Transférez la grille lavée dans une pince à épiler plongeante.
Une fois la grille fixée, retirez la pince à épiler de cinq par 15 et faites glisser la pince sur la pince à épiler plongeante. Insérez la grille dans le congélateur plongeant tout en maintenant la pince bien fixée. Ajoutez un microlitre de repères d’or à l’arrière de la grille.
Ajoutez ensuite deux à trois microlitres de PBS du côté carbone de la grille. Utilisez le transfert automatisé pour éponger l’arrière de la grille avant de plonger la congélation dans de l’éthane liquide. Une image cryocorrélative en microscopie optique et électronique de cellules U2OS transfectées a révélé la présence de cellules productrices du VIH.
Une image de cryotomographie électronique a montré que plusieurs particules de VIH bourgeonnaient de la membrane plasmique des cellules U2OS.
