Pour commencer, le jour zéro, préchauffer un milieu de différenciation sans sérum ou un milieu SFD contenant 1 cytokine Mix à 37 degrés Celsius. Ensuite, sous une hotte de culture tissulaire stérile, ajoutez le milieu supplémenté en cytokines Mix 1 dans chaque puits d’une plaque à six puits répulsif pour cellules. Pour préparer les cellules, aspirez le milieu de culture à partir d’une plaque à six puits contenant des cellules souches pluripotentes induites par l’homme ou des cellules IPS humaines.
Lavez-les avec du DPBS puis aspirez le DPBS. Ensuite, ajoutez le réactif de dissociation aux cellules et incubez-les à température ambiante pendant une minute. Après avoir aspiré ce réactif de dissociation, incubez les cellules pendant encore trois minutes à température ambiante.
Ensuite, appuyez 10 fois sur la plaque contenant les cellules de chaque côté pour détacher les grappes de cellules. Ajouter un millilitre de milieu SFD préchauffé Mix 1 supplémenté en cytokines aux cellules par puits. À l’aide d’une pipette de pâturage, transférer les amas cellulaires de chaque puits vers un puits de la plaque répulsive cellulaire contenant le milieu avec la cytokine Mix 1.
Après avoir introduit la plaque dans l’incubateur, déplacez-la d’avant en arrière, ainsi que d’un côté à l’autre, pour disperser le contenu uniformément et l’incuber pour la formation de corps embryoïdes, ou EB. Le lendemain, faites tourner la plaque répulsive contenant les EB pour les recueillir au centre des puits. À l’aide d’une pipette pasteur, transférer la suspension EB des puits dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.
Attendez cinq à 10 minutes pour que les EB se déposent au fond du tube. Pendant ce temps, lavez les plaques répulsives cellulaires avec de l’eau stérile ou du DPBS pour éliminer les cellules individuelles ou les débris. Ajouter deux millilitres de milieu SFD supplémenté en cytokines Mix 1 dans chaque puits de la plaque.
Maintenant, aspirez doucement le surnageant du tube à centrifuger sans déloger les EB. Remettre en suspension les EB dans le volume calculé du milieu SFD contenant la cytokine Mix 1. Ajouter un millilitre de suspension EB dans chaque puits de la plaque répulsive cellulaire lavée contenant déjà deux millilitres de milieu.
Incubez la plaque après avoir dispersé les EB en déplaçant doucement la plaque comme mentionné précédemment. Après avoir rassemblé les EB au centre des puits, ajoutez le chiron sur le côté de chaque puits, en évitant le contact direct avec les cellules, incubez les puits comme démontré précédemment. Les troisième et sixième jours de différenciation, collectez les EB et effectuez des changements de support comme indiqué précédemment pour le premier jour.
Utilisez le milieu SFD complété par le mélange de cytokines 3 le troisième jour et utilisez le milieu SFD complété par le mélange de cytokines 4 le sixième jour. Après avoir recueilli et décanté les EB de la plaque répulsive cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, comme démontré précédemment, aspirer le surnageant, puis ajouter un millilitre de réactif de dissociation cellulaire par puits d’EB collecté dans le tube pour remettre les EB en suspension. Ensuite, transférez un millilitre de cette suspension EB dans chaque puits de la plaque répulsive cellulaire lavée à l’eau.
Après avoir incubé la plaque pendant 10 minutes dans l’incubateur, utilisez une pipette P1000 pour dissocier les EB dans chaque puits en pipetant doucement de haut en bas pas plus de 10 fois. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon de lavage par puits d’EB dissociés. Collectez les cellules dans un tube à centrifuger de 50 millilitres en les faisant passer à travers une passoire de 40 microns.
Après avoir compté les cellules dans la suspension filtrée, faites tourner les cellules pendant 10 minutes à 300 g. Remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de tampon de lavage en pipetant doucement plusieurs fois, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de grumeaux. Procédez à l’isolement des cellules CD34 positives à l’aide d’un kit de microbilles CD34 selon les instructions du fabricant.
Les EB de bonne qualité ont montré un bord défini au deuxième jour de la différenciation et sont apparus clairs et brillants lorsqu’ils ont été observés au microscope. La présence de zones plus sombres indiquait la mort cellulaire dans les EB. Après un traitement par chiron avec des concentrations variables le deuxième jour, la quantification du nombre de cellules CD34 positives au huitième jour de différenciation a révélé la réponse de la lignée cellulaire au traitement.
La cytométrie en flux a montré que l’enrichissement en CD34 positif à l’aide des billes magnétiques fournissait environ 85 % de cellules CD34 positives.
