Placez la rétine de rat exprimant GCaMP 5G montée sur le MEA avec le GCL face aux électrodes sur la platine du microscope. Connectez le système de perfusion et réglez les paramètres pour perfuser en permanence le bain d’échantillon avec le milieu AMS oxygéné. Ensuite, inspectez la rétine à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé équipé d’une lampe fluorescente, d’un filtre FITC et d’une caméra CMOS.
Recherchez une zone où les électrodes de stimulation et la fluorescence des cellules exprimant GCaMP sont visibles. Dans le logiciel des dispositifs générateurs d’impulsions, configurez les paramètres de stimulation électrique tels que la forme, l’amplitude, la durée, le retard de phase et la fréquence des impulsions pour l’application. Connectez l’appareil photo au générateur d’impulsions à l’aide du signal de déclenchement de sortie et réglez le mode de capture du logiciel de l’appareil photo sur déclencheur de démarrage externe.
Appuyez sur le bouton de démarrage du logiciel de l’appareil photo afin qu’il attende un déclencheur externe pour démarrer. Lancez le processus d’acquisition d’images à l’aide du logiciel générateur d’impulsions et enregistrez les images capturées, en vous assurant que le nom du fichier inclut tous les paramètres de stimulation électrique appliqués. Ouvrez maintenant l’image J et segmentez la région d’intérêt à l’aide des outils de sélection de zone, ajoutez-la au gestionnaire de retour sur investissement et enregistrez-la en tant que dossier zip à l’aide du menu du gestionnaire de retour sur investissement.
Extrayez la valeur de gris moyenne des somas de la cellule en accédant à plus et en cliquant sur multi-mesure. Activez les options de mesure des 600 tranches et d’une ligne par tranche pour obtenir une table unique dans laquelle les colonnes correspondent aux ROI et les lignes correspondent aux périodes. Extrayez ensuite le centroïde des ROI à l’aide de la commande measure.
Pour corriger l’effet de blanchiment de la photo et minimiser l’arrière-plan, sélectionnez environ 15 à 20 images parmi les intervalles non stimulants avant chaque rafale et ajustez ces images à une courbe linéaire pour assurer une analyse optimale des données. Les traces calciques des somas cellulaires sur cinq rafales de trains d’impulsions toutes les 10 secondes au cours d’une acquisition d’image de 60 secondes sont représentées. Des montures des périodes non stimulantes sont utilisées pour corriger l’effet de photoblanchiment.
La relation entre le courant nécessaire pour activer les cellules et la distance de l’électrode de stimulation a montré que les cellules situées plus près de l’électrode de stimulation nécessitaient des valeurs de courant plus faibles pour provoquer une réponse.
