Commencez par préparer le milieu de culture endothélial complet en utilisant 460 millilitres de milieu de cellules endothéliales, et ajoutez-y 50 millilitres de FBS, cinq millilitres de pénicilline streptomycine et cinq millilitres de supplément de croissance des cellules endothéliales. Les milieux préparés peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant un mois. Ensuite, dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres contenant 0,1 million de cellules vasculaires à huit millilitres du milieu de culture endothélial complet préparé, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la co-fluidité de 70 % soit atteinte.
Ensuite, retirez le milieu de culture de la boîte et rincez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer les cellules non attachées et les débris. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine à 0,25 %, contenant 2,21 millimolaires d’EDTA dans les cellules et incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant une minute. Vérifiez le décollement des cellules au microscope optique à un grossissement de 40 fois.
Neutralisez la trypsine avec sept millilitres de milieu de culture endothélial complet et rincez doucement les cellules de la boîte de culture. Centrifugez la suspension cellulaire après l’avoir recueillie dans un tube de 15 millilitres à 400G pendant 10 minutes. Remettre les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture endothélial complet après avoir retiré le surnageant, puis compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transférer un volume calculé de suspension contenant 2 millions de cellules dans un tube stérile de 1,5 millilitre.
Granulez les cellules en centrifugeant la suspension à 400G pendant cinq minutes avant de retirer le surnageant. Les cellules vasculaires sont maintenant prêtes à être mélangées avec le gel matriciel pour le dosage du bouchon de gel matriciel.
