Commencez par incuber les fibres musculaires squelettiques du rat avec TMRE à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, lancez le logiciel standard du microscope confocal et choisissez le cadre de configuration. Dans la boîte de dialogue Configuration matérielle, sélectionnez Laser, puis cochez l’option Helium Neon 543.
Accédez à la boîte de dialogue d’acquisition via l’infrastructure d’acquisition et sélectionnez le panneau XYZ. Ensuite, sélectionnez le format 512x512 avec une vitesse de 400 hertz. Sous le panneau de sténopé affiché, sélectionnez des unités arbitraires et entrez trois zones pour le sténopé.
Dans la boîte de dialogue Paramètres du chemin de haricot, sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau 20x avec une ouverture numérique de 0,7 et une fenêtre de longueur d’onde d’émission comprise entre 576 et 700 nanomètres. Choisissez DD 488543 et réglez la puissance du laser 543 sur 15 %Après une incubation de 20 minutes, changez deux fois le milieu d’incubation. Ensuite, préparez la chambre d’enregistrement avec une lamelle en verre boro silicaté de 0,15 millimètre.
Transférez les faisceaux de fibres dans la chambre contenant 200 microlitres de solution détendue. Utilisez le mode fond clair du microscope confocal pour identifier les fibres viables pour l’enregistrement fluorescent des mitochondries. Ajustez, gagnez et décalez en balayant la fluorescence à l’aide du bouton Live.
Choisissez des valeurs d’intensité fluorescente faibles pour un bruit de fond proche de zéro unité arbitraire et un signal mitochondrial compris entre 100 et 200 unités arbitraires. Sélectionnez une taille de pixel comprise entre 150 et 190 nanomètres et ajustez le facteur de zoom dans la boîte de dialogue XY pour obtenir la pleine largeur de la fibre. Dans la boîte de dialogue Pile Z, définissez la distance Z à partir d’une profondeur de fibre de 15 micromètres jusqu’à 22 micromètres, puis choisissez une taille de pas Z de 3 micromètres.
Cliquez sur le bouton Démarrer pour acquérir les images confocaux et obtenir une pile Z composée de trois images confocaux acquises à 15, 18 et 21 micromètres de profondeur. Les images confocales d’une fibre musculaire d’enveloppement maigre exercée montrent un enregistrement attendu des mitochondries des fibres musculaires squelettiques avec un motif de fibres cohérent. En revanche, la fibre musculaire du rat obèse présente des altérations substantielles du contenu et de la distribution mitochondriales.
