Commencez par lancer le logiciel d’analyse d’images. Ensuite, ouvrez le fichier Z-stack et ajustez l’orientation pour placer la fibre horizontalement. Choisissez une région rectangulaire d’intérêt ou de retour sur investissement couvrant la zone mitochondriale.
Sélectionnez des tailles allant de 65 à 90 micromètres dans la direction X et des tailles appropriées dans la direction Y en fonction de la largeur de la fibre. Procédez à la duplication de la pile Z avec le retour sur investissement sélectionné. Et enregistrez-le en tant que nouvelle pile Z au format Tiff.
Enregistrez la position du retour sur investissement à partir de la pile d’origine à l’aide de l’outil Gestionnaire de retour sur investissement. Ouvrez la boîte de dialogue du seuil à l’aide du raccourci Commande+Maj+T. Choisissez l’algorithme de seuil Otsu et sélectionnez l’option Arrière-plan sombre noir et blanc.
Observez l’histogramme de la distribution de l’intensité de fluorescence et la valeur seuil affichée dans la boîte de dialogue. Appliquez le seuil à la pile d’images binaires, puis choisissez Calculer le seuil pour chaque image et créez une nouvelle pile dans la boîte de dialogue qui s’affiche avant de cliquer sur OK. Enregistrez la pile générée avec trois images binaires au format Tiff. Ensuite, accédez au menu Analyser et sélectionnez Histogramme.
Dans la boîte de dialogue Histogramme qui s’affiche, cliquez sur Oui. Et dans la boîte de dialogue Histogramme de la pile, cliquez sur Liste pour obtenir les données de l’histogramme. Transférez les données de l’histogramme vers une feuille de calcul et identifiez les mito-pixels avec une valeur de 255.
Calculez la densité mitochondriale en divisant les mito-pixels par le nombre total de pixels et en multipliant par 100. La fibre de rat obèse présentait une densité mitochondriale plus faible. Cela a été confirmé par l’analyse de l’image de la pile.
