Pour commencer, prenez 500 microlitres de la solution PBS/BEV préparée. Combinez-le avec trois millilitres de PBS et mélangez doucement à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres. Placez un tube d’ultracentrifugation de 31 millilitres sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez le tube avec une flèche vers le bas.
Ensuite, tenez verticalement une pipette de 1 000 microlitres et ajoutez trois millilitres de la solution d’iodixanol à 50 % au fond du tube. Placez un porte-tube légèrement au-dessus du niveau de la plaque de mousse sous l’ouverture du tube et inclinez le tube à un angle de 70 degrés. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez trois millilitres de solution d’iodixanol à 40 % sur la solution d’iodixanol à 50 %.
Ensuite, superposez trois millilitres de solution à 20 % d’iodixanol sur la solution à 40 % d’iodixanol. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez trois millilitres d’une solution à 10 % d’iodixanol sur la solution à 20 % d’iodixanol préparée. Ensuite, ajoutez 3,5 millilitres de solution PBS/BEV au-dessus de la solution d’iodixanol à 10 % et remettez doucement les tubes en position verticale.
Maintenant, positionnez un tube d’ultracentrifugation de 31 millilitres sur une plaque de mousse percée de trous et étiquetez-le avec une flèche vers le haut. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez verticalement 2,5 millilitres de solution mère d’iodixanol à 60 % dans le fond du tube et combinez-le avec 500 microlitres de solution PBS/BEV pour obtenir trois millilitres de solution BEV à 50 % d’iodixanol. Bien mélanger la solution par pipetage.
Ensuite, après avoir superposé une solution d’iodixanol à 40, 20 et 10 % en séquence, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter 3,5 millilitres de PBS à la solution d’iodixanol à 10 %. Ajustez le poids des deux tubes avec PBS à un poids total inférieur à plus moins 0,005 gramme. Ensuite, positionnez les tubes dans les seaux et centrifugez-les à 160 000 G pendant sept heures à quatre degrés Celsius.
À l’aide d’une pipette, recueillir les fractions obtenues à partir d’un mode d’ultracentrifugation à gradient de manière séquentielle de haut en bas contre la paroi latérale dans 10 tubes d’ultracentrifugation distincts de 38,5 millilitres. Ensuite, ultracentrifugez les fractions à 160 000 G pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et retournez les tubes d’ultracentrifugation pendant cinq minutes.
Ensuite, remettez les pastilles en suspension dans 200 microlitres de PBS pré-refroidi à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Transférez la solution PBS/BEV dans un microtube propre de 1,5 millilitre. Étiquetez les fractions de F1 à F10 comme obtenues à partir d’un mode d’ultracentrifugation à gradient et procédez à l’analyse.
