Pour commencer, maintenez la stérilité en nettoyant les gants, les cartouches et les plaques de culture avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, allumez le compresseur de la bio-imprimante et sélectionnez le bouton d’initialisation pour initialiser l’imprimante. Essuyez les surfaces à l’intérieur de l’imprimante avec de l’éthanol à 70 %.
À l’aide du bouton Print Run, chargez le fichier d’impression et ouvrez le PDF du protocole d’impression. Décongelez la bioencre, les fluides activateurs et 50 millilitres de substrat complet à température ambiante. Préparez la cartouche d’impression comme indiqué dans le PDF du protocole d’impression, en veillant à ce que les volumes de réactifs soient corrects dans les compartiments spécifiés.
Ensuite, ajoutez 1,2 millilitre de F3 à C1, 1,2 millilitre de F32 à C2 et 200 microlitres de F261 à C4. Retirez la plaque enduite de polyéthylénimine et de laminine de l’incubateur. Réglez le compartiment du porte-plaque sur une plaque à profil bas. Insérez la plaque dans le compartiment de support de plaque droit de l’imprimante.
Retirez le couvercle de l’assiette et placez-le dans le support de couvercle. Placez la cartouche d’impression dans la bio-imprimante et sélectionnez le bouton Base inerte d’impression pour lancer le tirage. Après décongélation, centrifuger les neurones glutamatergiques et les astrocytes, aspirer le surnageant et remettre en suspension les deux types de cellules séparément dans un millilitre de milieu complet.
Mélangez 20 microlitres de suspension cellulaire avec le même volume de bleu de trypan et comptez les cellules pour déterminer la concentration cellulaire viable pour chaque type de cellule. Ensuite, combinez 3 millions de neurones glutamatergiques avec 1 million d’astrocytes dans un tube de 15 millilitres et ajoutez un milieu complet pour obtenir un volume final de huit millilitres. Centrifuger la suspension cellulaire et aspirer le surnageant sans perturber la pastille.
Suspendez la pastille dans 200 microlitres de fluide activateur F299 en pipetant de haut en bas. Placez les couvercles sur la cartouche et la plaque de culture, puis retirez-les de la bio-imprimante. Dans une enceinte de sécurité biologique, ajoutez 200 microlitres de suspension cellulaire au puits C3 de la cartouche d’impression.
Réinsérez la cartouche dans la bio-imprimante et retirez le couvercle comme indiqué précédemment. Lancez l’étape des modèles d’impression du tirage. Dans le même temps, remplacez le support stratifié de la plaque de contrôle 2D par un support complet.
Insérez la plaque de ciblage de bio-impression dans la bio-imprimante et retirez le couvercle. Commencez le processus de ciblage de la bio-impression. Lorsque vous y êtes invité, retirez la plaque de ciblage de la bio-imprimante.
Utilisez le guide pour identifier les endroits où les gouttelettes peuvent être observées sur la plaque. Réinsérez la plaque de ciblage dans la bio-imprimante pour répéter le processus d’impression et de sélection des gouttelettes. Lorsque vous y êtes invité, remplacez la plaque de ciblage par une plaque de culture cellulaire.
Après l’impression, ajoutez un support complet à tous les puits de co-culture 3D et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Enfin, jetez les cartouches et les liquides restants. selon les protocoles de laboratoire.
Après sept jours d’impression, il ne restait presque plus de cellules et des faisceaux interconnectés de neurites et de projections astrocytaires semblaient fortifiés. La croissance des naurites a augmenté linéairement entre 12 et 156 heures. Au cours de la croissance des neurites, les amas de corps cellulaires ont également augmenté en taille.
L’analyse de la viabilité cellulaire a montré qu’environ 72 % des cellules totales étaient vivantes au quatrième jour, tandis que 29 % étaient mortes. L’immunomarquage a confirmé la morphologie cellulaire saine des neurones et des astrocytes bio-imprimés, les deux types de cellules présentant une excroissance de protubérances cellulaires. Le phénotype glutamatergique des neurones a été confirmé par immunomarquage pour le récepteur 2 du glutamate.
