Commencez par transférer la suspension de cellules tumorales pancréatiques préalablement décongelée dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres et ajoutez du PBS pour atteindre un volume final de deux millilitres. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour évaluer la quantité et la qualité des cellules. Une fois que la pastille de cellule est obtenue par centrifugation, à l’aide d’embouts de pipette de plus en plus petits, décantez soigneusement le surnageant pour minimiser la distribution de pastilles tout en maximisant le fluide décanté.
Préparez un tampon de lyse cellulaire 1X, puis ajoutez-en 100 microlitres à 900 microlitres de tampon de dilution de lyse cellulaire préalablement préparé pour obtenir un tampon de lyse cellulaire 0,1X. Transférez 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire 0,1X réfrigéré dans la pastille cellulaire et pipetez doucement cinq fois pour assurer une remise en suspension complète. Après l’incubation sur glace pendant trois minutes, ajoutez un millilitre de tampon de lavage réfrigéré à la pastille remise en suspension et pipetez-la doucement cinq fois.
Après la centrifugation, jetez le surnageant comme démontré et répétez ce processus de lavage deux fois de plus. Chargez une suspension colorée au bleu trypan dans un hémocytomètre pour compter le nombre de noyaux. Remettre en suspension la pastille de noyaux dans un tampon de noyaux 1X en fonction de la récupération des noyaux ciblés par l’objectif.
Passez délicatement les noyaux remis en suspension à travers une crépine à pointe de pipette de 40 micromètres, puis maintenez-les sur de la glace. Maintenant, comptez les noyaux. Les noyaux obtenus à l’aide de cette méthode présentaient une taille et une forme appropriées.
De légers pointillés occasionnels de l’enveloppe nucléaire peuvent être observés et doivent être surveillés lors de l’évaluation nucléaire finale à l’aide d’un hémocytomètre.
