Commencez par enrober le tissu pulmonaire et l’agarose et sectionnez-le à l’aide d’un vibratome. Aux tissus tranchés, ajoutez 300 microlitres de l’agent bloquant. Incuber l’assiette à quatre degrés Celsius sur un shaker en agitant doucement pendant 45 minutes.
Ensuite, pipetez 300 microlitres d’anticorps primaire dilué PBS dans chaque puits. Incuber l’assiette toute la nuit à quatre degrés Celsius en secouant doucement. Maintenant, pipetez doucement les anticorps primaires sans toucher la tranche.
Lavez les tranches trois fois avec 400 microlitres de PBS. Ensuite, pipetez 300 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans chaque puits. Retirez la solution d’anticorps après une incubation à froid pendant 90 minutes.
Ajoutez ensuite le DAPI et la lectine de tomate 488 dans les puits. Incubez le mélange pendant 30 minutes. Après avoir retiré le DAPI et la lectine de tomate, lavez les tranches dans du PBS pendant trois cycles de 10 minutes.
À l’aide d’un pinceau, transférez les tranches sur une lame. Placez trois gouttes de support de montage sur la diapositive et montez une lamelle de recouvrement dessus avant l’imagerie. Les coupes pulmonaires d’échantillons de souris, de porcs et d’humains ont été colorées par immunofluorescence pour l’amyotrophie spinale, l’élastine et la LEA.
On a observé que l’AS et l’élastine étaient distribuées dans des structures telles que les canaux alvéolaires, les vaisseaux sanguins, les bronchioles et les alvéoles. Une comparaison de la distribution des pneumocytes de type II chez l’homme adulte et le nourrisson a été réalisée. L’anticorps anti-cellules alvéolaires de type II HT2-280 avait une forte affinité pour la surface cellulaire des pneumocytes.
L’échantillon de nourrissons a donné un nombre significativement plus élevé de pneumocytes de type II. Cependant, l’échantillon de nourrissons présentait également une couverture d’échafaudage significativement plus élevée que celle de l’adulte. Le nombre de pneumocytes de type II basé sur la couverture d’échafaudage était également significativement plus élevé chez les nourrissons.
