Commencer la dilution de l’échantillon de sérum humain en mélangeant cinq microlitres de l’échantillon de sérum avec 120 microlitres de tampon d’analyse dans une plaque à 96 puits. Diluer jusqu’à huit fois supplémentaire en mélangeant 10 microlitres de la dilution initiale avec 70 microlitres de tampon d’essai. Maintenant, préparez 100 microlitres du mélange de billes contenant des billes couplées à l’antigène cible.
Ensuite, diluez le mélange de billes préparé dans 2,4 millilitres de tampon de dosage dans un tube Falcon. Commencer l’incubation du sérum en pipetant 25 microlitres de la suspension de billes dans des puits désignés. Ajoutez 25 microlitres de sérum dilué 200 fois dans les puits avec la suspension de billes.
Recouvrez la plaque de réaction à 96 puits d’un joint de microplaque. Incubez ensuite l’assiette avec des billes sur un agitateur d’assiette. Après l’incubation, retirez la plaque de réaction à 96 puits de l’agitateur à plaques.
Placez la plaque dans une rondelle magnétique et retirez le joint de la plaque adhésive. Ensuite, lavez les billes trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage, puis aspirez le volume de lavage final des billes après la dernière étape de lavage. Pour la première incubation d’anticorps, commencez par préparer un nouveau mélange de réactifs de détection double IgG et IgM dans un tampon de dosage.
Pipeter 30 microlitres de réactif de détection dans chaque puits désigné, puis couvrir la plaque de réaction à 96 puits avec un joint de microplaque. Incuber la plaque dans un agitateur d’assiette pendant 45 minutes à 20 degrés Celsius à 750 tours par minute. Après l’incubation, placez la plaque dans une laveuse de plaques magnétique et retirez la pipette adhésive de 30 microlitres de striptavidine diluée étiquetée BV421 dans chaque puits de réaction après avoir lavé les plaques comme précédemment.
Placez ensuite la plaque scellée sur un agitateur à assiette pour l’incubation ultérieure. Une fois l’incubation terminée, lavez la plaque et remettez les billes en suspension dans les puits jusqu’à un volume final de 100 microlitres à l’aide du tampon de lavage. Pour analyser les résultats, recouvrez la plaque de réaction à 96 puits d’un joint de microplaque.
Ensuite, incubez l’assiette couverte pendant trois minutes à 20 degrés Celsius à 1000 tours par minute sur un agitateur d’assiette. Transférez la plaque de l’agitateur à l’analyseur de débit à double rapporteur. Enfin, évaluez l’intensité fluorescente médiane de l’échantillon, ou MFI, en suivant les instructions du fabricant.
L’analyse de corrélation de Spearman pour trois antigènes représentatifs de Borrelia a démontré une reproductibilité uniforme des valeurs de l’IMF lors de la détection d’anticorps anti-Borrelia présents dans les sérums humains. Le test à double rapporteur a montré une bonne reproductibilité d’un essai à l’autre avec une grande précision inter-essais démontrée par les diagrammes de Levey-Jennings. À des dilutions d’échantillon de 100 à 12 800 fois, les courbes de dilution pour la détection des IgM et la détection des IgG étaient similaires pour les deux instruments.
Les valeurs de l’IMF étaient légèrement plus élevées dans l’instrument à rapporteur unique.
