Pour effectuer une SPR pour les interactions VHL-MZ1, activez d’abord la puce streptavidine conformément aux instructions du fabricant Pour obtenir la concentration la plus élevée, ajoutez un tampon sans DMSO au MZ1 pour assurer une concentration de DMSO de 2 %. Maintenant, pipetez 50 microlitres de la solution la plus concentrée dans un puits contenant 100 microlitres du tampon de fonctionnement. Mélangez bien pour obtenir la deuxième concentration la plus élevée.
Ensuite, transférez 50 microlitres de la solution dans les 100 microlitres suivants de tampon courant, mélangez bien pour préparer la troisième concentration la plus élevée, et ainsi de suite. Utilisez des feuilles de plastique transparent autocollantes compatibles avec les microplaques en polypropylène pour recouvrir la plaque. Lancez le SPR à l’aide de la configuration multicycle.
Réglez le mode à haute performance, le temps de contact à 120 secondes, le temps de dissociation à 300 secondes et le débit à 50 microlitres par minute. Utilisez le logiciel d’évaluation fourni par le fabricant de l’instrument pour effectuer l’analyse des données. Pour effectuer une SPR pour le complexe ternaire VHL-MZ1-BRD4, activez d’abord la streptavidine.
Injecter la solution VHL pour l’immobiliser à environ 100 unités de résonance. Pour le contrôle négatif utilisant uniquement BRD4, préparez la concentration la plus élevée de 25 micromolaires dans le tampon en cours d’exécution avec un volume de 200 microlitres. Aux quatre puits suivants, ajoutez 160 microlitres de BRD4 à deux micromolaires.
Transférez 40 microlitres du puits A5 à A4. Ensuite, pipetez le puits pour bien mélanger. De même, transférez 40 microlitres du puits A4 à A3, en continuant ce processus jusqu’à ce que vous atteigniez A1. Pour la formation de complexes ternaires avec MZ1 et BRD4, pipeter 196 microlitres de solution BRD4 à 25,5 micromolaires. À cela, ajoutez quatre microlitres de MZ1 à 20 micromolaires préparés dans une solution 100% DMSO.
Pipeter 160 microlitres de BRD4 à deux micromoles dans le tampon de fonctionnement jusqu’aux quatre puits suivants à gauche. Ensuite, transférez 40 microlitres du puits B5 vers B4 et pipetez pour bien mélanger. Continuez à transférer la solution de chaque puits jusqu’à B1. Faites maintenant fonctionner le SPR sur la configuration à cycle unique avec un temps de contact de 100 secondes, un temps de dissociation de 720 secondes et un débit de 50 microlitres par minute.
La caractérisation du complexe binaire VHL-MZ1 et du complexe ternaire VHL-MZ1-BRD4 a été réalisée. Une coopérativité positive a été observée. La caractérisation des systèmes cereblon, PROTAC et PPM1D a été réalisée par SPR.
Les expériences PPM1D utilisent une puce NTA en nickel, et la surface de la puce est régénérée après chaque injection de composé. BRD-2512, qui ne se lie qu’au céréblon, et BRD-4761, qui ne se lie qu’à PPM1D, présentent une réponse de liaison négligeable. BRD-5110 induit la formation d’un complexe ternaire entre PPM1D et montre un effet d’accroche à des concentrations élevées de composés.
