Commencez par cultiver les échantillons d’œillets isolés de souris à régime gras régulier ou à régime riche en graisses pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Concevoir les conditions expérimentales souhaitées pour l’étude. Pour chaque condition expérimentale, à l’aide d’une pipette, prélever 100 œillets dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant deux millilitres de milieu à œillets.
Pour induire la mitophagie, traitez les œillets dans les boîtes de Pétri appropriées avec deux microlitres de stock de valinomycine à 250 nanomolaires pendant trois heures. Isolez les œillets et, à l’aide d’une pipette, transférez les œillets de chaque boîte de Pétri dans un microtube à centrifuger séparé. Ensuite, faites tourner les œillets à 350 G pendant une minute à 10 degrés Celsius et, à l’aide d’une pipette, jetez le surnageant.
Lavez l’échantillon obtenu deux fois avec un millilitre de PBS. Entre les lavages, essorer l’échantillon et jeter le surnageant comme indiqué précédemment. Pour dissocier les œillets en cellules individuelles, ajoutez 500 microlitres de trypsine à 0,05 % préchauffée à 37 degrés Celsius, dans un tube d’échantillon.
Pipetez le contenu du tube de haut en bas à plusieurs reprises jusqu’à ce que les œillets soient visiblement dispersés. Ajouter immédiatement un millilitre de milieu à œillet préchauffé pour neutraliser la trypsine. Faites tourner les échantillons à 500 G pendant cinq minutes à 10 degrés Celsius.
Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille. Ensuite, lavez les échantillons deux fois avec un médium à œillets. Les échantillons de cellules sont maintenant prêts à être colorés pour l’analyse par cytométrie en flux de la mitophagie des cellules bêta.
