Procéder à l’analyse par cytométrie en flux de la mitophagie des cellules bêta, avec une suspension cellulaire unique d’environ 100 îlots miroirs isolés préparés, correspondant à chaque condition expérimentale souhaitée à étudier. Tout d’abord, remettez en suspension les échantillons d’îlots pour chaque condition dans 500 microlitres de milieu d’écoulement d’îlots. Ajouter 0,25 microlitre de bouillon MtPhagy dans les tubes désignés pour recevoir le colorant MtPhago.
De même, ajoutez 0,25 microlitre de bouillon TMRE et de bouillon fluozine-3-AM dans les tubes désignés respectifs. Enveloppez les tubes dans du papier d’aluminium et faites vortex chaque tube à basse vitesse pendant cinq secondes pour mélanger le contenu. Ensuite, incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
À mi-chemin de l’incubation, faire tourbillonner chaque échantillon à basse vitesse pendant cinq à 10 secondes. Après incubation, centrifugez les tubes à 350 G pendant une minute à 10 degrés Celsius. Jeter le surnageant.
Et remettre les échantillons en suspension dans 500 microlitres de milieu d’écoulement d’îlots. Ajoutez du DAPI aux tubes de microcentrifugation contenant des échantillons qui nécessitent un traitement DAPI. Centrifugez à nouveau et jetez le surnageant comme indiqué précédemment.
Remettre le résidu en suspension dans 500 microlitres de milieu d’écoulement d’îlots. Enfin, placez les échantillons sur de la glace, puis procédez à la cytométrie en flux. Ajustez les tensions pour la diffusion directe ou FSC et la diffusion latérale ou SSC pour vous assurer que les populations cellulaires sont au centre du nuage de points.
Pour exclure les multiplets, à une porte rectangulaire sur la hauteur FSC par rapport à la largeur FSC, suivie de la hauteur SSC par rapport à la largeur SSC. Ajustez les tensions et la compensation pour DAPI afin de filtrer les cellules bêta vivantes. Définissez des grilles de fluorescence pour chaque fluorophore utilisé en fonction de l’échantillon RFD non coloré.
Une fois les points de contrôle établis, collectez 10 000 événements par échantillon. Les cellules bêta à forte utilisation de la mitophagie ont été définies comme la population à forte teneur en fluozine, à forte teneur en MtPhago, à haute TMRE, dans le quadrant trois ou Q3. Les taux de mitophagie basale et induite par la valinomycine ont été caractérisés dans les îlots RFD et HFD.
