Pour évaluer la mitophagie dans les cellules bêta pancréatiques murines à l’aide du rapporteur de mitophagie génétiquement codé, cultivez des îlots pancréatiques isolés de souris de type sauvage et de souris Mt-Keima pendant une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez 100 îlots dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant deux millilitres de milieu d’îlots pour chaque condition expérimentale utilisée dans ce protocole. Ensuite, dissocier les œillets en cellules individuelles et colorer avec FluoZin-3-AM et DAPI comme démontré précédemment pour l’approche à base de colorant Mt-Phago.
Procédez ensuite à l’analyse par cytométrie en flux des échantillons. Ajustez les tensions de diffusion directe ou FSC et de diffusion latérale ou SSC pour obtenir une distribution uniforme des cellules sur un tracé SSCA par rapport à FSCA. Pour sélectionner des cellules individuelles et exclure des multiplets, ajoutez une porte rectangulaire sur la hauteur FSC par rapport à la largeur FSC, suivie de la hauteur SSC par rapport à la largeur SSE.
Les multiplets sont exclus en raison de leurs valeurs de signal de largeur plus élevées. Configurez ensuite une porte négative DAPI pour exclure les cellules mortes. Après cela, configurez des portes positives FluoZin-3-AM pour filtrer les cellules bêta vivantes.
Mettre en place un schéma de contrôle triangulaire à l’aide de l’échantillon positif Mt-Keima pour identifier les populations de cellules acides et neutres. Une fois que les portes primaires et de fluorescence ont été établies, évaluer le flux de mitophagie à l’aide des changements induits par la fluorescence basale et la valinomycine dans la fluorescence Mt-Keima.
