Pour commencer, prenez une souris anesthésiée et appliquez une goutte de 1 % de tropicamide et de 2,5 % de phényléphrine dans l’œil pour dilater la pupille. Appliquez ensuite un gel ophtalmique sur la cornée pour prévenir la sécheresse et les cataractes induites par l’anesthésie. Ensuite, installez un microscope opératoire vertical avec un trajet de lumière directe dans un environnement stérile pour effectuer l’injection sous-rétinienne.
Pour préparer la seringue en verre de 10 microlitres, détachez le moyeu de l’aiguille et fixez l’aiguille émoussée de calibre 33. Prenez le couvercle du moyeu métallique et fixez solidement l’aiguille sur la seringue. Rincez l’aiguille avec de l’eau distillée pour tester les fuites et la perméabilité de l’aiguille.
Videz ensuite la seringue et mettez-la de côté soigneusement. Ensuite, positionnez la souris anesthésiée sur un coussin et orientez l’œil de traitement vers l’objectif du microscope. Appliquez 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne et attendez 30 secondes.
Appliquez ensuite 150 microlitres de gel ophtalmique sur l’œil et fixez une lamelle ronde. Effectuez un examen préliminaire de la vue en observant la cornée, l’iris, la pupille, le cristallin et la conjonctive. Ajustez le plan focal pour visualiser le fond d’œil de la souris à travers la pupille.
Alignez ensuite la tête de manière à ce que la tête optique s’aligne avec le centre de la pupille. Ensuite, tapotez la base du tube contenant des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de HESC pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. À l’aide d’une seringue en verre de 10 microlitres avec une aiguille émoussée de calibre 33, prélever deux microlitres de mélange cellulaire.
Utilisez une aiguille jetable de calibre 30 pour créer une plaie de sclérectomie positionnée à deux millimètres derrière le limbe. Maintenez l’angle de l’aiguille à environ 45 degrés pour éviter tout contact avec la lentille. Une fois que la pointe de l’aiguille devient visible dans l’œil, rétractez soigneusement l’aiguille.
Jetez l’aiguille usagée dans un bac pointu pour éviter les blessures par piqûre d’aiguille. Prenez maintenant la seringue en verre et insérez l’aiguille émoussée dans la plaie de sclérectomie. Faites avancer l’aiguille émoussée sans toucher la lentille jusqu’à ce qu’elle atteigne la rétine opposée à la plaie d’entrée.
Pénétrez doucement dans la rétine jusqu’à ce qu’une branche de pression sur la sclérotique soit visible. Injectez ensuite deux microlitres de la suspension cellulaire ou du milieu PRDM dans l’espace sous-rétinien tout en maintenant une légère pression sur la seringue. La formation d’une tache visible indique une injection réussie.
Attendez 10 secondes pour permettre aux cellules de se calmer. Rétractez doucement l’aiguille de l’œil. Pour visualiser la tache, déplacez la tête de la souris pour positionner l’œil sous le microscope et fixez la position en tenant doucement la tête.
Pour l’OCT peropératoire, utilisez la fonction IOCT sur le microscope opératoire et sélectionnez cube sur l’écran OCT. Positionnez la zone de numérisation sur le BLB en appuyant sur les boutons fléchés. Pour régler l’OCT, faites glisser le centrage et la mise au point pour obtenir la meilleure qualité OCT, appuyez sur Capture ou Scan pour acquérir le scan OCT de la zone de bleb et examinez les images pour vérifier la qualité des numérisations.
Enfin, retirez la lamelle et nettoyez délicatement le gel de l’œil à l’aide d’une gaze. Administrer une pommade antibiotique une fois après l’injection pour prévenir l’infection. L’OCT a révélé des entités HESC distinctes en suspension dans l’œil traité par cellule.
En revanche, l’œil traité présentait un liquide non trouble, dépourvu de cellules dans l’espace sous-rétinien.
