Pour commencer, remplissez un verre Dounce avec deux millilitres de tampon de lyse des noyaux glacés contenant 0,01 % de digitonine et ajoutez-y les morceaux de tissu cérébral de souris disséqués. À l’aide d’un homogénéisateur de tissus Dounce en verre, homogénéisez le tissu 25 fois chacun avec les pilons A et B, et transférez l’homogénat obtenu dans un tube de 15 millilitres. Ajouter deux millilitres de tampon de lyse des noyaux glacés contenant 0,01 % de digitonine à l’homogénat et incuber sur de la glace pendant cinq minutes.
Ensuite, centrifugez les noyaux à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, retirez le surnageant et ajoutez quatre millilitres de tampon de lyse des noyaux glacés contenant 0,01 % de digitonine. Filtrer la suspension des noyaux à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres.
Centrifugez à nouveau les noyaux, retirez le surnageant et ajoutez quatre millilitres de tampon de coloration pour laver les noyaux. Après avoir filtré la suspension à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres, granulez les noyaux par centrifugation et remettez les noyaux en suspension dans un millilitre de PBS contenant 0,04 % d’inhibiteurs de BSA et de RNase. Pour compter les cellules, mélangez 10 microlitres de bleu de trypan à 0,4 % avec 10 microlitres de noyaux dans un tube de 0,5 millilitre.
Comptez les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Transférez 100 microlitres des noyaux dans un tube FACS pour le contrôle non coloré. Ajouter 10 microlitres de 7-AAD aux noyaux restants et incuber pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis procéder au tri des noyaux à l’aide de FACS.
Ensuite, transférez 10 microlitres des noyaux triés dans un nouveau tube FACS contenant 90 microlitres de DPBS avec 2% de FBS inactivé par la chaleur. Après avoir centrifugé les noyaux triés, retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette et remettre les noyaux en suspension dans 100 microlitres de tampon de noyaux dilués. Avant le tri, l’échantillon contient des débris substantiels avec plus de 99 % de singulets positifs pour la coloration nucléaire, ce qui indique une lyse cellulaire efficace.
Les noyaux cérébraux après tri ont démontré une augmentation de la pureté de 36 % à près de 100 %
