Pour commencer, prenez un flacon contenant les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices de la moelle osseuse de souris. À l’aide d’une micropipette, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse ACK et incuber pendant une à deux minutes à température ambiante. Transférez le mélange remis en suspension dans un tube de 50 millilitres à travers la crépine de cellules pré-humidifiée de 70 micromètres.
Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon FACS pour diluer le tampon de lyse ACK. Centrifugez le mélange à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et remettez le granulé en suspension dans 10 millilitres de tampon FACS en le remettant d’abord en suspension dans un millilitre de tampon, puis en complétant avec neuf millilitres de tampon. Maintenant, mélangez 10 microlitres de bleu de trypan à 0,4 % avec 10 microlitres de cellules dans un tube de 0,5 millilitre et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
Pour colorer les cellules, centrifugez les cellules à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remettre le granulé en suspension dans le tampon FACS pour obtenir une concentration finale d’une fois 10 à sept cellules par millilitre en remettant d’abord le granulé en suspension dans un millilitre de tampon, puis en complétant avec le volume restant. À l’aide d’une micropipette P1000, transférez la suspension dans un tube FACS à travers un capuchon de crépine de 35 micromètres.
Ensuite, préparez le mélange de coloration comme indiqué ici. Après centrifugation, remettre en suspension la suspension cellulaire dans 300 microlitres de colorant, mélanger un dans un tube d’échantillon et incuber sur de la glace pendant 15 minutes à l’abri de la lumière. Ajoutez ensuite 300 microlitres de mélange deux dans le tube d’échantillon et incubez pendant 20 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.
Ajouter trois millilitres de tampon FACS aux tubes d’échantillons colorés et colorés mélangés. Maintenant, centrifugez la suspension cellulaire. Après avoir éliminé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS.
Préparez un tube de 1,5 millilitre prérempli de 500 microlitres de milieu de collecte. Une fois l’instrument FACS étalonné, ajoutez 500 microlitres de tampon FACS à la suspension cellulaire, puis transférez un millilitre de l’échantillon à travers un capuchon de crépine cellulaire de 35 micromètres dans un nouveau tube FACS. Après le tri des cellules, transvasez 10 microlitres des cellules triées dans un nouveau tube FACS contenant 90 microlitres de tampon FACS.
Granuler la suspension cellulaire par centrifugation et la remettre en suspension dans 50 microlitres de PBS avec 0,04% de BSA. Transférez la suspension dans un tube de 0,2 millilitre et ajoutez 50 microlitres de PBS avec BSA dans le tube d’origine pour recueillir les cellules restantes. Transférez les cellules dans le tube de 0,2 millilitre pour atteindre un volume total de 100 microlitres.
Mener une expérience pilote pour déterminer le meilleur moment de lyse pour l’isolement des noyaux. Après avoir granulé les noyaux, remettre en suspension les granulés de noyaux dans 12 microlitres de tampon de noyaux dilués. Ajoutez deux microlitres de noyaux dans un tube contenant 0,4 % de bleu de trypan et huit microlitres de PBS avec 0,04 % de BSA et comptez les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
Après avoir terminé l’isolement des noyaux, transvaser six microlitres de noyaux remis en suspension dans un nouveau tube FACS pré-rempli de 150 microlitres de tampon FACS. Ajoutez trois microlitres de 7-AAD et incubez pendant cinq minutes sur de la glace.
