Pour commencer, étiquetez deux nouveaux tubes de télécopie en tant que tubes mixtes un et deux. Préparez la cellule et la suspension d’anticorps selon le tableau donné pour l’analyse par cytométrie en flux. Après avoir incubé les tubes pendant 30 minutes, lavez chaque tube deux fois avec un millilitre de tampon de coloration.
Centrifuger les tubes vortex à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon de coloration. Enduisez les puits d’une plaque de 48 puits de 200 à 500 microlitres de FBS, et conservez pendant une heure.
Pipeter ensuite 200 à 500 microlitres de milieu 10 % MSC après avoir retiré le FBS résiduel. Pour préparer les échantillons pour le tri à cellule unique, pipetez un millilitre de FBS dans deux nouveaux tubes de télécopie. Roulez les tubes pour créer une couche uniforme de FBS sur la surface intérieure du tube.
Préparez la cellule et la suspension d’anticorps dans des tubes mixtes un et deux, selon le tableau, pour l’expérience de tri. Incubez ensuite les tubes dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Après le lavage avec un tampon de coloration, centrifugez les tubes à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon de coloration et incubez-le pendant 15 minutes dans cinq microlitres de DAPI avant le tri. Pour mettre en place la matrice de compensation, utilisez les tubes de compensation de taches simples. Cliquez sur expérience dans la barre d’outils du logiciel de l’instrument.
Cliquez ensuite sur Configuration de la rémunération, puis sur Créer des contrôles de rémunération. Ensuite, cliquez sur tube non coloré, puis sur les paramètres dans la boîte de dialogue du cytomètre. Ajustez les tensions en modifiant les valeurs de chaque paramètre.
Cliquez sur charger dans le tableau de bord d’acquisition, puis cliquez sur acquérir. Faites glisser la grille P-1 vers la population de cellules et appliquez-la à toutes les commandes de compensation pour définir la tension et la grille négative pour chaque paramètre. Chargez maintenant les tubes de compensation de taches individuels individuellement.
Enregistrez les données et sauvegardez-les. Sélectionnez l’expérience actuelle, cliquez dessus avec le bouton droit de la souris, puis sélectionnez Calculer les valeurs de compensation, puis cliquez sur le lien et enregistrez. Exécutez le tube mixte et enregistrez 10 000 cellules.
Définissez les portes sur la population d’intérêt à trier avec la stratégie de contrôle appropriée. Ensuite, chargez une plaque de collecte dans l’instrument et définissez un nombre de cellules cibles, allant de 2 500 à 5 000 cellules par puits. Sélectionnez ensuite le masque de pureté de tri à cellule unique.
Collectez les populations de cellules triées dans un dispositif de collecte, en les gardant sur la glace pendant toute la durée de l’expérience de tri. Enfin, placez les plaques dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pour maintenir les cultures à 37 degrés Celsius. Les diagrammes d’essais de cytométrie en flux multiparamétrique n’ont montré aucune expression de l’isotype FITC des anticorps FITC CD 90.
L’expression positive des marqueurs CD-90 et CD-73 et l’expression négative de CD-45 sont comparables à celles de leurs témoins non colorés et FMO. Les immunophénotypes ont montré la distribution des marqueurs à partir de l’un des premiers passages avec les marqueurs recommandés par l’ISCT et CD-44, déterminant les populations parentales comme des CSM. Les hangars à passage tardif ont été utilisés pour le tri des cellules individuelles des expresseurs hauts et faibles.
Les cellules post-triées recueillies dans la plaque à 48 puits ont montré une adhérence et une prolifération, comme leur population parente. Les cellules post-triées se sont différenciées en présence de facteurs de croissance adipogéniques.
