Pour préparer les puits de culture, marquez le couvercle d’une plaque à 24 puits avec le code du donneur A ou B, la date et la dose. Retirez les flacons cryogéniques contenant du sang humain de l’azote liquide et décongelez-les partiellement au bain-marie jusqu’à ce que de petits cristaux de glace soient visibles. Ensuite, dans une hotte à flux laminaire, ouvrez soigneusement le flacon pour éviter que des bulles d’air ne se répandent à l’intérieur du tube.
Remettre en suspension et transférer le contenu du flacon dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Tout en faisant doucement tourner le tube, goutte à goutte, ajoutez un millilitre de PBS préchauffé. Utilisez une pipette P-1000 pour mélanger le PBS et le sang.
Pour une dilution et un lavage uniforme, ajoutez sept millilitres de PBS préchauffé dans le tube de 15 millilitres et mélangez par pipetage. Centrifuger le sang à 180 g pendant huit minutes. Pendant ce temps, remplissez les puits non étiquetés d’une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de PBS et préchauffez la plaque à 37 degrés Celsius.
Après centrifugation, retirez délicatement le surnageant, en laissant environ un millilitre dans le tube sans perturber la palette. À l’aide d’une pipette, remettre la palette en suspension dans le surnageant restant. Ensuite, ajoutez progressivement huit millilitres de PBS chaud dans le tube comme démontré précédemment.
Centrifuger le sang remis en suspension. Pendant ce temps, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture RPMI dans les puits marqués et préchauffez la plaque comme démontré. Après centrifugation, retirez le surnageant, en laissant environ 80 microlitres de surnageant.
Ajoutez ensuite 280 microlitres de sérum de veau fœtal et remettez la palette en suspension. Transférez 180 microlitres de la suspension cellulaire dans les puits marqués. Incubez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
