Après avoir cultivé un échantillon de sang cryoconservé décongelé, irradiez-le avec les doses de rayons X requises à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1,62 millilitre de milieu de culture RPMI chaud dans chaque puits. Pour stimuler la division cellulaire dans les lymphocytes T, ajoutez 40 microlitres de phytohémagglutinine dans chaque puits et remettez en suspension soigneusement.
Incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 23 heures. Le lendemain, ajoutez huit microlitres de cytochalasine B par puits pour bloquer la cytokinèse. Après 70 heures, retirez la plaque de l’incubateur et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.
Rincez bien chaque puits avec deux millilitres de PBS et ajoutez ce PBS dans le tube de 15 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 180 G pendant huit minutes et jetez le surnageant, en laissant 500 microlitres sur la pastille. Tout en faisant vortex la pastille, ajoutez deux millilitres de chlorure de potassium froid dans le tube.
Encore une fois, centrifugez et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Vortex la pastille en ajoutant lentement deux millilitres de fixateur froid 1 et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez et jetez le surnageant.
Tout en faisant vortex la pastille goutte à goutte, ajoutez deux millilitres de fixateur froid 2 dans le tube. Laissez le tube toute la nuit à quatre degrés Celsius. Centrifuger l’échantillon et transférer le surnageant dans un autre tube pour concentrer les cellules en fonction de la taille des pastilles.
Nettoyez les lames avec de l’isopropanol et étiquetez-les correctement. Après avoir vortex la pastille, ajoutez 40 microlitres de suspension à cellules fixes sur une lame. Après séchage, plongez la lame dans une tache d’acridine orange pendant une minute.
Ensuite, lavez rapidement la lame avec de l’eau distillée avant de la placer dans un tampon phosphate pendant une minute. Séchez le dos de la diapositive et placez-la sur du papier de soie propre. Ajoutez 20 microlitres de tampon phosphate sur la lame et couvrez-la d’une lamelle propre, en évitant les bulles d’air.
Scellez la lame avec du ciment de silicone. Placez la lame sous un microscope à fluorescence et examinez les cellules binucléées. Enfin, comptez manuellement les micronoyaux.
La présence de cellules binucléées arrondies indiquait une récupération réussie de cellules saines viables à partir d’échantillons de sang total cryoconservés. Avec l’augmentation des doses de rayonnement, une augmentation quadratique linéaire du rendement en micronoyaux a été observée. Les rendements de fond en micronoyaux dans les échantillons témoins simulés irradiés résultaient principalement de chromosomes retardés.
