Effectuez l’isolement des cellules de niche limbique, ou LNC, tout en travaillant dans des conditions stériles sur un établi ultra-propre. Récupérez le tissu limbique du milieu de stockage cornéen à moyen terme. À l’aide d’une lame ronde chirurgicale stérile, grattez et retirez l’iris et l’endothélium autour de la cornée.
Ensuite, à l’aide de la lame ronde chirurgicale stérile, coupez le tissu du limbe en 12 morceaux égaux, en ne laissant qu’un millimètre de tissu des deux côtés de la cornée et de la sclère. Après cela, transférez les 12 morceaux de tissu limbique sur une plaque de culture de 35 millimètres et ajoutez 1 millilitre de collagénase A pour immerger complètement les tissus dans la plaque. Digérer les tissus en incubant la plaque de culture dans un incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 18 heures.
Décongelez le matrigel ou la matrice de la membrane basale dans un réfrigérateur réglé à 4 degrés Celsius. Préparez un sac stérilisé contenant des pointes de 200 microlitres et 1 millilitre, un tube à centrifuger de 15 millilitres et une plaque à 6 puits, et placez le sac à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après avoir récupéré les pointes, le tube de centrifugation et la plaque à 6 puits du refroidisseur, procédez aux étapes suivantes sur un établi ultra-propre.
À l’aide d’un embout pré-refroidi de 200 microlitres, pipetez 50 microlitres de la matrice de la membrane basale décongelée dans 1 millilitre de MESCM et mélangez-le doucement. À l’aide d’un embout pré-refroidi de 1 millilitre monté sur une pipette, transférez la matrice membranaire basale à 5 % résultante dans un seul puits de la plaque de culture pré-refroidie à 6 puits. Agitez doucement la plaque à 6 puits horizontalement avant de la placer dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ une heure pour préparer la plaque de culture enrobée de matrigel à 5 %.
Après la digestion de 18 heures, récupérez le tissu limbique digéré de la collagénase A, contenant principalement de petits amas visibles. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour détacher les amas des tissus scléraux non digérés. Immergez les amas détachés dans 0,25 % de trypsine-EDTA dans une plaque de culture de 35 millimètres et incubez la plaque pendant 15 minutes.
Ensuite, ajoutez 1 millilitre de MESCM avec 10% de sérum knockout dans la plaque pour désaltérer la digestion cellulaire. Pipetez doucement la suspension de haut en bas avec une pointe de pipette de 1 millilitre pour diviser les grappes en cellules individuelles. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-la à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante.
Sans perturber la pastille cellulaire, retirez délicatement le surnageant et ajoutez 1 millilitre de MESCM pour remettre les cellules en suspension. À l’aide d’un embout de pipette de 1 millilitre, pipetez le contenu de haut en bas deux à trois fois pour vous assurer que la totalité de la pastille est remise en suspension dans MESCM. Prélevez 20 microlitres de la suspension pour le comptage des cellules.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, transférez la suspension cellulaire sur la matrice de membrane basale à 5 % recouverte d’une plaque à 6 puits. Ajoutez MESCM pour que le volume total dans le puits soit de 2,5 millilitres. Secouez doucement la plaque à 6 puits horizontalement pour assurer une répartition uniforme des cellules.
Après avoir imagé les cellules, transférez-les dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius. Le protocole démontré a permis de digérer avec succès le tissu du bord scléral de la cornée, générant des amas qui ont pu être visualisés au microscope. Comme on pouvait s’y attendre, les grappes ressemblaient à la forme d’une chenille.
Les LNC primaires se développaient lentement et nécessitaient environ 12 jours pour la culture. Il a fallu environ trois jours pour passer les LNC du passage 1 au passage 8, mais le taux de croissance des LNC après le passage 9 a considérablement diminué. Morphologiquement, les LNC étaient fusiformes et ronds dans le passage 0.
Après le passage 3, ils étaient en forme de fuseau avec des tailles uniformes. Le nombre de doublements cellulaires ou MNT représentait le taux de croissance des LNC. Les courbes de MNT et de MNT cumulées ont révélé que les MNT ont connu la croissance la plus rapide entre le passage 3 et le passage 5.
