Pour identifier les cellules de niche limbique ou LNC par coloration par immunofluorescence, ajouter 1 millilitre d’EDTA à 0,25 % de trypsine par puits aux LNC cultivés dans une plaque à 6 puits recouverte de 5 % de matrigel. Digérez les cellules en incubant la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Désaltérez la digestion en ajoutant 1 millilitre de sérum knockout contenant du MESCM à la suspension cellulaire.
Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et centrifugez-la à 200 g pendant cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le surnageant. Remettre le granulé en suspension dans un millilitre de MESCM. Ensuite, à l’aide d’un cytofuge, déposez 80 microlitres de la suspension cellulaire de manière égale sur quatre lames de microscope selon les instructions du fabricant.
Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant environ 10 minutes. Ensuite, perméabilisez les cellules sur les lames en utilisant 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 minutes. Bloquez les cellules avec de l’albumine sérique bovine à 2 % pendant une heure avant de les incuber avec des anticorps primaires sur un agitateur pendant une nuit à 4 degrés Celsius.
Après l’incubation, éliminez les anticorps non liés en lavant les lames avec PBST trois fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, incubez l’échantillon avec des anticorps secondaires appropriés à 37 degrés Celsius pendant une heure avant de laver les anticorps non liés comme démontré précédemment. Contre-colorer les noyaux avec du DAPI ayant une concentration de 5 microgrammes par millilitre.
Après avoir scellé les lames, effectuez une imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence. À l’aide d’un kit d’isolement de l’ARN, extrayez l’ARN total des LNC selon les instructions du fabricant. Ensuite, à l’aide d’un kit de transcription d’ADN complémentaire ou d’ADNC de grande capacité, transcrivez inversement 1 à 2 microgrammes de l’ARN.
Préparez une solution de 20 microlitres contenant 2,5 microlitres d’ADNC, 0,8 microlitre d’amorce génétique correspondante, 10 microlitres d’un mélange maître PCR universel et 6,7 microlitres d’eau double distillée. Effectuez ensuite une réaction en chaîne par polymérase quantitative en utilisant les conditions appropriées. Enfin, utilisez la technique comparative de la tomodensitométrie pour examiner l’expression relative des gènes.
La double immuno-coloration des LNC du quatrième passage a clairement révélé que ces cellules étaient systématiquement panCK négatives, VIM positives, CD90 positives, CD105 positives, SCF positives et PDGFR positives.
