Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Pour commencer, perfusez la solution externe avec une solution saline oxygénée pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, transférez 10 microlitres de la solution de dissection dans une boîte de Pétri. Maintenant, utilisez des aiguilles de seringue et un microscope pour disséquer soigneusement le cerveau des mouches sauvages et knock-out anesthésiées et établies.

À l’aide d’une pipette, transférez le cerveau préparé dans une boîte d’enregistrement contenant cinq millilitres de solution externe. Immobiliser le cerveau à l’aide d’un do dièse. Ensuite, capturez l’image confocale de chaque cerveau à 20x.

Utilisez le mode de balayage XYT et identifiez les neurones du corps du champignon à une amplification numérique supplémentaire de 4,5 fois. Réglez l’excitation laser à 488 nanomètres avec une puissance laser de 16 microwatts pour acquérir l’émission GCaMP6m du cerveau entier. Réglez ensuite les paramètres de numérisation sur une vitesse de 1400 avec une taille de pixel de 256 x 256 pixels.

Réglez le taux d’acquisition sur 5,3 hertz et enregistrez pendant trois minutes. Analysez la fluorescence de cinq à huit régions d’intérêt. Déterminez manuellement le corps cellulaire des neurones du corps du champignon comme région d’intérêt.

Utilisez l’image J pour marquer les neurones identifiés et mesurer leurs intensités de fluorescence. Analysez les données de fluorescence de GCaMP6m comme indiqué. Définissez la fluorescence intracellulaire augmentant entre deux et 2,5 écarts-types comme de petits pics et ceux augmentant de plus de 2,5 écarts-types comme de grands pics.

Des signaux calciques ont été observés dans le corps des champignons des mouches. Les mouches cac knockdown ont montré plus de gros pics que de petits pics.