Commencez par modifier chimiquement les fractions protéiques regroupées par méthylation réductrice. Pour ce faire, prenez la protéine purifiée et ajoutez-y 20 millimolaires de diméthylamine borane, suivie de 40 millimolaires de formaldéhyde. Incuber le mélange dans un agitateur oscillant pendant deux heures à quatre degrés Celsius.
Ensuite, ajoutez 10 millimolaires supplémentaires de borane de diméthylamine au mélange. Ensuite, incubez le mélange pendant la nuit pendant 12 à 18 heures à quatre degrés Celsius. Éteignez la réaction en ajoutant 100 millimolaires de chlorure de tris ayant un pH de 7,5.
Utilisez le tampon de lavage et le tampon d’élution appropriés pour charger la protéine méthylée sur une colonne nickel-NTA. Tout d’abord, lavez la colonne nickel-NTA de deux millilitres avec 10 volumes de tampon de lavage de colonne. Et ensuite, éluez la protéine avec le tampon d’élution.
Après l’élution, faire passer l’éluat de protéine à travers une colonne de dessalage-10, pré-équilibrée avec le tampon approprié. Ajoutez le cholestérol préparé dans de l’isopropanol ou de l’éthanol à la protéine dessalée et incubez le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, ultracentrifugez le mélange à 150 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Ajouter le surnageant collecté dans un concentrateur centrifuge avec une coupure de 100 kilodaltons, et concentrer le surnageant jusqu’à une concentration finale de 30 à 50 milligrammes par millilitre. Une fois de plus, centrifugez la protéine concentrée à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée de paillasse à grande vitesse et retirez la pastille. Placez le surnageant recueilli sur la glace à quatre degrés Celsius avant de procéder à la cristallisation.
Les protéines alkylées stockées à quatre degrés Celsius ont été analysées par chromatographie analytique par filtration sur gel pendant un mois. Et il a montré une légère perte de protéines après une semaine.
