Pour commencer, prélevez l’échantillon de vésicule extracellulaire séchée obtenu à partir de l’urine humaine en utilisant l’approche du piège EV. Préparez un tampon de lyse frais avec les composants illustrés. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon de lyse pour solubiliser l’échantillon EV séché.
Chauffer l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes tout en agitant à 1 100 tr/min. Après avoir refroidi l’échantillon à température ambiante, diluez-le cinq fois en ajoutant 400 microlitres de TEAB de 50 millimolaires. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage BCA selon les instructions du fabricant.
Ajouter le mélange de trypsine et de lysine C à l’échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 1 100 tr/min. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’acide trifluoroacétique à 10 % ou TFA pour acidifier l’échantillon. De plus, ajoutez 600 microlitres d’acétate d’éthyle aux échantillons et faites tourbillonner le mélange pendant deux minutes.
Centrifuger l’échantillon pendant trois minutes à 20 000 G et retirer délicatement la couche supérieure sans perturber l’interface. Séchez la phase aqueuse à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide. Maintenant, remettez l’échantillon séché en suspension dans 200 microlitres de 0,1% d’AGT pour acidifier les peptides.
Pour dessaler l’échantillon, utilisez une buse de dessalage CA18 et conditionnez-le avec 200 microlitres d’AGT à 0,1 % et d’acétonitrile à 80 %, suivis de deux lavages avec 200 microlitres d’AGT à 0,1 %. Chargez l’échantillon de peptide acidifié dans la pointe et lavez-la trois fois avec 200 microlitres de 0,1% TFA. Éluer les peptides avec 200 microlitres de 0,1% TFA et 80% d’acétonitrile.
Après avoir prélevé l’éluant comme démontré, remettre en suspension l’échantillon séché à la phosphoprotéomique dans 200 microlitres de tampon de charge pour l’enrichissement en phosphopeptide. Ajouter 50 microlitres de billes à l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 20 minutes à température ambiante. Chargez l’échantillon avec les billes dans la pointe fritted et centrifugez pendant une minute à 100 G.Lavez successivement la pointe avec 200 microlitres de tampon de chargement, en lavant les tampons un et deux.
Placez l’embout avec les billes dans un nouveau tube pour recueillir les phosphopeptides éludés. Ajouter 50 microlitres de tampon d’élution à la pointe et centrifuger pendant deux minutes à 20 G.Ensuite, sécher les phosphopeptides échappés à l’aide d’un concentrateur de centrifugation sous vide.
