Pour commencer, préparez des échantillons de protéome et de phosphoprotéome des vésicules extracellulaires isolées à partir des échantillons d’urine en utilisant l’approche EVtrap. Injectez les échantillons dans le spectromètre de masse à temps de vol à mobilité ionique piégée à travers le système de chromatographie en phase liquide. Séparez les peptides dans une colonne C18 de 15 centimètres.
Pour l’analyse protéomique, acquérir des données à l’aide de la méthode dia-PASEF avec une plage de masse par rampe allant de 300 à 1200 rapport masse/charge et constante de mobilité ionique de 0,6 à 1,50 1/nœud. Pour l’analyse phosphoprotéomique, acquérir des données à l’aide d’une méthode d’acquisition dia-PASEF. Réglez la plage de masse par rampe pour qu’elle s’étende de 400 à 1550 rapport masse/charge dans une constante de mobilité ionique de 0,6 à 1,50 1/nœud.
Chargez les fichiers bruts dans un logiciel protéomique. Paramétrez les paramètres de recherche dans la base de données homo sapiens. Pour Digest Type (Type de synthèse), sélectionnez Spécifique et, sous Enzymes, sélectionnez TrypsinP.
Définissez la longueur du peptide à un minimum de 7 et à un maximum de 52 et laissez deux clivages manqués. Définissez ensuite le nombre maximal de modifications de variable sur 5. La modification fixe doit être le carbamidométhyle au niveau de la cystine, tandis que les modifications variables doivent inclure la protéine acétylique N-terminale, l’oxydation au niveau de la méthionine et la phosphorylation au niveau de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine.
Enfin, définissez le taux de fausses découvertes pour la correspondance du spectre peptidique, le peptide et le groupe de protéines sur 0,01. Dans le profilage protéomique LCMS et MS, 2 % de chaque échantillon a révélé plus de 11 000 peptides uniques provenant d’environ 2 200 protéines. Notamment, 72 % des protéines uniques ont été systématiquement trouvées dans les trois répétitions et 90 marqueurs et protéines de la VE ont été identifiés par rapport à la base de données ExoCarta.
La précision quantitative a été confirmée avec un coefficient de variation faible-moyen de 5,7 %, ce qui signifie une reproductibilité et une fiabilité élevées. Pour la phosphoprotéomique, 98 % de chaque échantillon peptidique a donné 800 phosphopeptides uniques et 350 phosphoprotéines. L’enrichissement a donné 72 % de phosphosérine, 22 % de phosphothréonine et 6 % de peptides de phosphotyrosine.
42 % des phosphopeptides ont été identifiés dans toutes les répétitions avec un coefficient de variation moyen de 21,8 %, ce qui indique une reproductibilité quantitative acceptable.
