Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Pour le test de phénotypage, effectuez l’expérience d’exposition à la lumière sur des embryons de poisson-zèbre exprimant bOpto-BMP bOpto-Nodal, et retirez-les de la boîte à lumière un jour après la fécondation entre 24 et 32 HPF. À l’aide d’un endoscope de dissection, évaluez les phénotypes et établissez une grille d’évaluation. Évaluez les embryons pendant qu’ils restent dans le chorion pour plus de commodité.

Utilisez une pipette pour sonder afin de repositionner les embryons sous différents angles. Pour le test d’immunofluorescence, après avoir incubé des embryons dans du formaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit, retirez le formaldéhyde et rincez-les trois à cinq fois avec du PBST. Jetez le PBST et ajoutez 100 % de méthanol.

Scellez les tubes et retournez-les doucement pour mélanger le PBST résiduel et le méthanol. Après avoir lavé les embryons deux fois de plus avec du méthanol, conservez-les à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures jusqu’à plusieurs années. À l’aide d’un microscope équipé pour la coupe optique, capturez des images d’embryons immunocolorés.

Des expériences de coloration par immunofluorescence avec des quantités d’ARNm appropriées et des conditions d’exposition à la lumière ont montré que les niveaux de pSmad étaient similaires et non injectés dans les embryons non exposés, tandis que les embryons exposés à la lumière injectée présentaient des niveaux plus élevés de phosphorylation de Smad.