Pour commencer, obtenir une pastille cellulaire après dissociation du tissu du SNC et la remettre en suspension avec 3 100 microlitres de DPBS dans un tube de 15 millilitres. Ne pas vortex. Ajoutez 1 800 microlitres de la solution d’élimination des débris du kit de dissociation cérébrale adulte à deux suspensions de cellules du SNC regroupées.
Retournez le tube et mélangez la suspension, puis recouvrez-le doucement de 4 millilitres de DPBS froid et observez un dégradé clair. Centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 3 000 g à 4 degrés Celsius avec une accélération complète et sans interruption. Après centrifugation, trois phases se forment.
Aspirez complètement les deux phases supérieures et jetez-les, en veillant à ce qu’il ne reste aucun résidu de myéline. Remplissez le tube avec du DPBS froid jusqu’à 14 millilitres et fermez-le. Retournez le tube avec force sur l’établi jusqu’à ce que la pastille de cellule se détache du fond du tube.
Centrifuger l’échantillon et aspirer complètement le surnageant. Pour l’élimination des globules rouges, ajoutez 1 millilitre de la solution d’élimination des globules rouges à la pastille cellulaire. Après avoir remis la pastille en suspension, incubez la solution pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.
Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon PB froid, centrifugez l’échantillon et aspirez complètement le surnageant. Pour le comptage cellulaire, diluer la suspension cellulaire de 50 fois dans un tampon PB, puis de 1 à 10 dilutions dans une solution de bleu de trypan à 0,4 %. Déterminez ensuite le nombre de cellules, à l’aide d’une chambre de comptage améliorée.
