Pour commencer, placez le réactif de dissociation cellulaire HBSS EGM-2 et le DMEM dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Décongeler la thrombine et la laminine pendant la nuit à 4 degrés Celsius et le fibrinogène à température ambiante. Ajoutez 1,5 microlitre de thrombine dans un tube de microcentrifugation de 500 microlitres.
Placez des plaques à haut débit stérilisées aux UV dans un dessiccateur pendant 30 minutes pour éliminer l’air emprisonné dans la microfluidique. Placez le flacon T75 sous le microscope à un grossissement de 4x pour confirmer la confluence cellulaire et l’efficacité de la transduction. Lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de HBSS.
Ensuite, ajoutez un millilitre de réactif de dissociation dans le flacon et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une à deux minutes. Tapotez doucement le flacon à l’aide de la paume et observez au microscope que toutes les cellules ont été soulevées. Lavez les cellules avec neuf millilitres de milieu approprié et collectez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres.
Retirez immédiatement une petite aliquote et comptez les cellules. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 G et quatre degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu approprié sur de la glace.
À l’aide de l’équation donnée, calculez le nombre de cellules nécessaires. Remettre les cellules en suspension à une concentration de 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre, et calculer le volume de cellules nécessaires à l’aide de l’équation suivante. Centrifuger le volume requis de suspension cellulaire tel que démontré.
Ensuite, dans un volume calculé de fibrinogène, remettre le granulé en suspension sur de la glace.
