Pour commencer, placez les plaques à haut débit stérilisées aux UV et les aliquotes de thrombine dans la hotte de culture tissulaire. Placez le mélange de fibrine cellulaire préparé sur de la glace pour ralentir la coagulation. À l’aide d’une pipette P20, prélever six microlitres du mélange de fibrine cellulaire.
Placez ensuite délicatement l’embout de la pipette dans l’aliquote de thrombine et mélangez deux fois sans introduire de bulles d’air. Soulevez la plaque à haut débit en biais et insérez rapidement la pointe de la pipette dans l’un des orifices de chargement. Poussez le piston de la pipette jusqu’à la première butée dans un mouvement doux et fluide et injectez le mélange de fibrine cellulaire dans la chambre à tissus.
Assurez-vous que le gel traverse entièrement la chambre. Placez délicatement la plaque à plat sans retirer la pointe de la pipette ni déplacer la pipette. Retirez l’embout de la pipette à l’aide d’une main du P20 et laissez-le dans le trou de l’orifice de chargement.
Au bout de deux minutes, retirez les pointes de pipette des orifices de chargement en les tordant doucement et placez le couvercle sur la plaque. Incuber la plaque pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius pour la polymérisation du gel. Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope pour observer la répartition uniforme des cellules dans la chambre sans aucune bulle d’air.
Insérez l’embout de pipette P20 dans M1 ou M3 et expulsez lentement quatre microlitres de laminine pour recouvrir l’ensemble du panneau supérieur. Retirez l’embout de la pipette comme indiqué précédemment et incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Ajouter 275 microlitres de milieu complet EGM-2 dans les réservoirs non couplés des puits situés dans les rangées A et B.Insérez la pointe de la pipette P200 dans le trou d’entrée du milieu des puits contenant 275 microlitres d’EGM-2 et expulsez lentement 75 microlitres de milieu, en regardant le milieu voyager à travers le canal et bouillonner de l’autre côté.
Après avoir retiré l’embout de la pipette, poussez le milieu restant de l’embout dans le réservoir de média. Ajouter 50 microlitres de substrat pour recouvrir entièrement les puits latéraux inférieurs des rangées G et H.Incuber les plaques pendant une à deux heures comme démontré. À l’aide d’un microscope, identifiez les bulles dans les canaux multimédias et éliminez-les en réintroduisant 75 microlitres de médias dans les canaux.
Vérifiez à l’œil nu les entrées ou les sorties du fluide pour détecter la présence de bulles d’air. Insérez ensuite l’embout de pipette P200 dans le trou et retirez la bulle en soulevant le piston. Dans les micro-organes vascularisés ou VMO, les cellules endothéliales se sont d’abord réparties uniformément dans la chambre tissulaire, mais dès le deuxième jour, elles ont commencé à s’étirer et à s’illuminer.
Au quatrième jour, les cellules endothéliales se sont anastomosées avec les canaux microfluidiques externes, formant un réseau vasculaire continu. La fonction de barrière vasculaire serrée a été confirmée par la perfusion de FITC-dextran à travers le réseau microvasculaire avec une fuite minimale. La perfusion de cellules cancéreuses MDA-MB-231 dans les VMO a entraîné leur adhérence à la muqueuse endothéliale et leur extravasation subséquente dans l’espace extracellulaire, formant de multiples micrométastases dans les 24 heures suivant la perfusion.
Grâce à l’imagerie microscopique en accéléré, l’extravasation des lymphocytes T dans l’espace extracellulaire des VMO a été observée pendant 45 minutes. Dans les micro-tumeurs vascularisées avec des vaisseaux entièrement formés, les lymphocytes T ont rapidement adhéré à la paroi vasculaire lors de la perfusion.
