Pour commencer le prélèvement de moelle osseuse, trempez un rat euthanasié dans de l’éthanol à 75 % pour stériliser la fourrure et la peau. Allongez le rat sur le dos et coupez les membres inférieurs de la hanche pour protéger la tête du fémur. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper le ligament au niveau de l’articulation du jarret.
Repliez ensuite l’articulation du genou vers l’arrière pour exposer le fémur et le tibia. Avec une paire de pinces et de ciseaux, retirez soigneusement tous les muscles, tendons et autres tissus connectés aux os. Percez la moelle à travers les deux extrémités des os avec une seringue à aiguille de 5 millimètres pour détacher la matrice de moelle.
Utilisez maintenant une seringue fraîche pour rincer la moelle osseuse avec 10 à 15 millilitres de milieu RPMI. Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à 300 G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 à 10 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.
Après avoir incubé la suspension, ajoutez quatre fois le volume de HBSS au mélange. Ensuite, centrifugez les cellules à 600G pendant cinq minutes à température ambiante. Utilisez le granulé obtenu pour une utilisation ultérieure.
Isolez d’abord les neutrophiles avec une trousse d’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse du rat. Couche 2 millilitres de réactif 80-55% par colonne dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, pour créer un gradient de densité. Ensuite, pipetez les neutrophiles isolés, ou la solution de remise en suspension des cellules isolées avec le kit d’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse de rat, dans le tube.
Centrifugez le tube à 800G pendant 40 minutes à 20 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette stérile, prélevez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches cellulaires à la limite de 65 à 70 %. Transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres.
Ajoutez 15 millilitres de HBSS dans le tube et retournez doucement pour mélanger son contenu. Enfin, centrifugez le tube à 300G pendant 10 minutes à température ambiante pour granuler les cellules. Pour le processus en une étape, après avoir pipeté la suspension de moelle osseuse directement dans le tube à gradient de densité, centrifuger comme démontré précédemment.
Ensuite, pipetez la couche de gradient de 70 %, y compris les couches à la limite du gradient de 75 à 70 %. Transférez cette suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres avec 10 millilitres de HBSS. Ensuite, centrifugez le tube à 400G pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les cellules.
Compter les neutrophiles isolés à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan. La méthode en deux étapes avait un niveau de pureté amélioré de 90 % par rapport aux 50 % obtenus par la méthode en une étape.
