Extraction and Analysis of DNA from the Cellular Component of the Eye Humor

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January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200816-v

January 12th, 2024

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Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

Transcription

Pour effectuer l’extraction de l’ADN, ajoutez d’abord une quantité appropriée de solution de lyse cellulaire à la pastille cellulaire obtenue à partir de l’humeur oculaire. Pipetez la solution de haut en bas pour bien la mélanger. Une fois que les cellules sont complètement lysées, ajoutez une solution de précipité protéique pour constituer un tiers du volume total.

Maintenant, tourbillonnez et mélangez vigoureusement pendant 20 à 30 secondes. Ensuite, faites-le tourner pendant trois minutes à 3000g à température ambiante. Pendant ce temps, transférez 300 microlitres d’isopropanol dans un tube de microcentrifugation propre.

Une fois la centrifugation terminée, pipeter soigneusement le surnageant dans le tube contenant de l’isopropanol. Ensuite, ajoutez 1,5 microlitre de glycogène dans le tube et retournez le tube pour bien mélanger. Placez le tube à moins 20 degrés Celsius dans un congélateur pendant une heure ou toute la nuit pour faciliter la précipitation de l’ADN.

Après congélation, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 3000g à température ambiante. Ensuite, pipetez l’isopropanol. Pour laver le granulé, ajoutez 0,5 millilitre d’éthanol à 70 %.

Retournez doucement le tube pour assurer un lavage uniforme. Faites ensuite tourner le tube pendant une minute à 3000g à température ambiante. Jetez le surnageant du tube à centrifuger.

Maintenant, retournez le tube sur de la gaze propre pour drainer la solution et sécher la pastille. Après un tour rapide dans la microcentrifugeuse, utilisez un embout de pipette jetable à pointe fine pour pipeter la gouttelette d’éthanol restante. Ensuite, ajoutez 45 microlitres de solution d’hydratation d’ADN à la pastille d’ADN séché.

Placez ensuite le tube dans un bloc chauffant réglé à 50 degrés Celsius. Les rendements en ADN des composants cellulaires et acellulaires des fluides oculaires étaient similaires. Une analyse PCR des composants cellulaires et acellulaires d’une mutation associée au lymphome vitréo-rétinien a été réalisée.

Un taux de mutation plus élevé était présent dans la composante acellulaire, comme le démontre l’abaissement du seuil de cycle.

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