Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

Pour commencer, ajoutez 70 microlitres de tampon de conditionnement pour chaque millilitre d’infraction surnée acellulaire de l’humeur oculaire. Faire vortex les billes de dégagement pour bien mélanger. Ensuite, ajoutez les perles à l’échantillon, puis faites vortex l’échantillon et les mélanges de perles.

Centrifugez ce mélange à 3000 G pendant 15 minutes à température ambiante. Sans déloger la pastille, extraire le surnat, puis ajouter un volume égal de tampon de digestion de pastille d’urine à la pastille. Pipetez la solution de haut en bas pour remettre la pastille en suspension.

Ajoutez maintenant la protéinase K au mélange de granulés remis en suspension. Incubez le mélange à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis ajoutez un volume égal de tampon de lyse génomique au mélange de digestion. Vortex soigneusement la solution pour bien la mélanger.

Maintenant, placez la colonne d’essorage disponible dans le commerce dans un nouveau tube de collecte. Ajoutez un tampon de préparation de l’ADN urinaire de 200 microlitres dans la colonne de spin. Centrifuger à 16 000 g pendant une minute à température ambiante et jeter l’écoulement.

Maintenant, pipeter 700 microlitres d’urine tampon de lavage de l’ADN à la colonne et à la centrifugeuse comme démontré. Après avoir éliminé l’écoulement, transférez la colonne de centrifugation dans un tube à centrifuger sans DNase, sans RNase. Enfin, ajoutez le volume approprié de tampon d’élution d’ADN directement dans la matrice de colonne et laissez-le reposer pendant trois à cinq minutes à température ambiante, puis centrifugez à nouveau pour obtenir de l’ADN acellulaire.

Les rendements en ADN des composants cellulaires et acellulaires des fluides oculaires étaient similaires. Une analyse PCR des composants cellulaires et acellulaires d’une mutation associée au lymphome vitréo-rétinien a été réalisée. Un taux de mutation plus élevé était présent dans la composante acellulaire, comme le démontre un seuil de cycle abaissé.