Pour commencer, retirez la moelle épinière d’une souris décapitée qui a été perfusée avec du PBS. Immergez la moelle épinière dans du DPBS froid dans une boîte de Pétri sur de la glace. À l’aide d’une aiguille de calibre 18 et d’une seringue de 10 millilitres remplie de DPBS froid, utilisez l’extrusion hydraulique pour isoler toute la moelle épinière dans une hotte à flux laminaire.
Transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec du DPBS froid placé sur des blocs réfrigérants. À l’aide d’un microscope à l’intérieur de la hotte à flux laminaire, retirez soigneusement les méninges visibles à l’aide d’une pince tranchante. Ensuite, transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri vide et utilisez une lame de scalpel chirurgical n ° 10 pour la couper en sections de deux à trois millimètres de long.
Pour la dissociation enzymatique des cellules spinales, ajoutez les mélanges d’enzymes 1 et 2 aux morceaux de moelle épinière. Faites tourner les enzymes dans le plat plusieurs fois pour assurer un revêtement uniforme de la moelle épinière. Incubez le plat à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en remuant manuellement le plat toutes les 10 minutes.
Après incubation, ajoutez 350 microlitres de DNAse I.Remuez doucement le plat pour mélanger. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM froid complété par 0,5% FBS avant de mélanger délicatement. Transférez immédiatement tout le contenu dans un tube de cinq millilitres.
À l’aide d’une pipette P1000, triturez doucement le tissu trois fois. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur en verre bouchée de neuf pouces pour triturer doucement le tissu cinq fois de plus. Placez le tube à la verticale pendant 30 secondes pour permettre au tissu de se déposer.
À l’aide d’une pipette P1000, aspirez le surnageant et transférez-le à travers un filtre de 30 micromètres dans un tube conique de 15 millilitres. Dans le tube avec les tissus restants, ajoutez un millilitre de DMEM supplémenté en FBS. Ensuite, triturez doucement trois fois avec une pipette Pasteur.
Après avoir laissé le tissu se déposer au fond, passez le surnageant à travers un filtre de 30 micromètres et collectez-le dans le même tube de 15 millilitres que celui utilisé précédemment. Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Utilisez un aspirateur sous vide pour éliminer soigneusement le surnageant.
Utilisez la solution d’élimination des débris fournie dans le kit de dissociation cérébrale adulte pour éliminer la myéline de la pastille cellulaire. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DMEM supplémenté en FBS à la pastille et retournez doucement le tube trois fois pour mélanger. Après centrifugation, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de DPBS supplémenté en FBS.
Centrifugez à nouveau avant de jeter le surnageant. Marquez les cellules avec des microbilles anti-ACSA-2 en suivant le protocole du fabricant. Utilisez les colonnes de séparation magnétiques pour séparer les cellules par sélection positive.
Ensuite, centrifugez les cellules à 300 g pendant 10 minutes avant de jeter le surnageant. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de DMEM chaud supplémenté en FBS. Transférez la suspension cellulaire dans un hémocytomètre pour compter les cellules et évaluer leur viabilité.
Ajustez la concentration cellulaire à 75 000 cellules par 50 microlitres avec FBS DMEM. Ensuite, transférez 50 microlitres de la suspension cellulaire sur une lamelle recouverte de poly-l-lysine dans une plaque à 24 puits. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle.
Ensuite, ajoutez soigneusement 450 microlitres de FBS DMEM chaud et supplémenté en antibiotiques dans chaque puits. L’isolement et la prolifération des microglies et des astrocytes ont été observés. Au quatrième jour, on a observé que les astrocytes formaient des processus plus longs, tandis que des cellules microgliales ovales avec des fuseaux plus courts ont été observées.
Les astrocytes ont formé une couche confluente connectée au septième jour, la microglie présentant des processus moins nombreux et plus courts. Le tri cellulaire a confirmé la viabilité cellulaire de 92 à 93 % de la culture cellulaire isolée.
